复方首乌藤合剂微生物限度检查的验证

张 婷，郑绍忠，刘全芳

解放军第一七五医院（厦门大学附属东南医院）药剂科，福建 漳州 363000

微生物限度检查是药品安全性检查的重要项目，目前在国外也越来越受到重视，每版药典收载的品种也越来越多。复方首乌藤合剂是我院自制的中成药口服液，有滋阴清肝、清心安神作用，主要用于神经衰弱性失眠、眩晕及脑外伤性头痛、头昏等。《中国药典》2010年版规定建立微生物限度检查法时，应对该方法进行验证，以确定该方法的可行性。笔者依据《中国药典》2010年版二部附录[1]对该品种进行了菌落计数和控制菌检查方法的验证[2]。

1 仪器与试药

1.1 仪器

DG-2B多功能恒温箱（上海医疗器械厂）；HWS-400型恒温恒湿箱（上海精宏实验设备有限公司）；LDZX-40SCI型立式自动电热压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；101-2A型数显式电热恒温干燥箱（上海阳光实验仪器有限公司）。

1.2 药品

复方首乌藤合剂（解放军第一七五医院制剂室，40 ml/瓶，批号：100609、100623、100721）。

1.3 试验用菌株

大肠埃希菌（escherichia coli）[CMCC（B）44102]、金黄色葡萄球菌（staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]、枯草芽孢杆菌（bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]、黑曲霉（aspergillus niger）[CMCC（F）98003]和白色念珠菌（candida albicans）[CMCC（F）98001]，以上菌种均购于厦门市药品检验所，金黄色葡萄球菌为第三代，大肠埃希菌为第二代，其余菌均为第四代。

1.4 培养基

营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、改良马丁琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、MUG培养基，以上培养基均购于广东环凯微生物科技有限公司。

1.5 稀释液

pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液，购于广东环凯微生物科技有限公司。

2 方法与结果

2.1 菌落计数方法的验证[3]

2.1.1 供试液的制备

用pH 7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液将复方首乌藤合剂稀释成为1∶10的供试液，充分混匀备用。

2.1.2 菌液制备

2.1.2.1 取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物用接种棒接种至营养肉汤培养基中，于（35±1）℃培养 18～24 h。

2.1.2.2 取白色念珠菌的新鲜培养物用接种棒接种至改良马丁琼脂培养基中，于（25±1）℃培养 24～48 h；

上述培养物均用灭菌生理盐水制成每毫升含菌数小于100 cfu的菌悬液，做活菌计数用。

2.1.2.3 取黑曲霉新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基中，于（25±1）℃培养 5～7 d，使黑色的霉菌孢子大部分覆盖培养基斜面为宜，加入5 ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯-80的灭菌生理盐水并轻轻振摇洗脱下霉菌孢子，过滤孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯-80的灭菌生理盐水制成每毫升含菌数小于100 cfu的菌悬液，做活菌计数用。

2.1.3 菌落计数方法的验证操作

试验组：分别吸取上述制备好的1∶10供试液1 ml注入平皿中，再分别加入上述制备好的的5种菌的菌悬液各1 ml，每种菌平行制备2份，立即倾注营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基。

供试品对照组：分别吸取上述制备好的1∶10供试液1 ml注入平皿中，立即倾注营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基，每种培养基平行制备2份，以测定供试品的本底菌数。

菌液组：取上述制备好的5种菌的菌悬液1 ml注入平皿内，每种菌平行制备2份，立即倾注营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基，测定所加的试验菌数，并计算回收率。回收率公式为回收率（%）＝（试验组菌落计数-供试品对照组菌落计数）/菌液组菌落计数×100%。

以上营养琼脂培养基置30～35℃培养48 h，玫瑰红钠琼脂培养基置23～28℃培养72 h，结果见表1。

表1 各试验菌株的回收率

由表1可见，笔者对复方首乌藤合剂采用平皿法，经过3次平行试验，5种菌的回收率均大于70%。故本品的细菌、霉菌、酵母菌数的测定可依据《中国药典》2010年版直接取样采用常规法。

2.2 控制菌检验方法的验证[4]

2.2.1 阳性试验组

取上述1∶10供试液10 ml加至100 ml胆盐乳糖培养基中，再加入10～100 cfu的大肠埃希菌，依相应控制菌检查方法进行检查。

2.2.2 阴性菌对照组

方法同试验组，阴性对照菌采用金黄色葡萄球菌，依相应控制菌检查方法进行检查。见表2。

表2 控制菌的方法验证结果

从表2可以看出，采用常规法检验复方首乌藤合剂的控制菌，阳性试验组呈阳性反应，阴性菌对照组呈阴性反应，故可用该法进行复方首乌藤合剂控制菌的检查。

3 讨论

验证试验结果表明复方首乌藤合剂无抑菌作用，可依据《中国药典》2010年版按常规方法进行微生物限度检查。

笔者发现，复方首乌藤合剂静置一段时间后会生成沉淀，在试验时，应充分摇匀，使其分散均匀，且本品虽进行了10倍稀释，但颜色依然较深，在光线较暗的环境下进行菌落计数时不容易分辨菌落，因此应在光源充足的环境下进行菌落计数，对疑似菌须进行菌落培养，确定其是否为菌，以免发生漏数、少数现象，造成试验结果不准确。

菌落数的控制在小于100 cfu/ml是试验过程的一大难点，是一项较耗时的操作过程，通常需要多次实践才能够得到符合要求的菌落数。菌落的生长繁殖能力极其旺盛，呈指数级别递增，因此，在用接种棒接种至相应培养基进行增菌，并进行稀释这个过程的重现性很差，很难在同一个稀释级得到相同数目的菌落数，笔者通过多次试验，并查阅相关资料，发现可将细菌稀释至10-6（真菌稀释至10-5），并在其附近选取稀释至10-5～10-7（真菌选取10-4～10-6）的菌悬液，每个稀释级取1.0 ml与0.5 ml同步试验，可大大提高菌落数在100 cfu/ml的范围，减少一些繁琐且不必要的操作。

[1]国家药典委员会.中国药典[S].二部.北京:中国医药科技出版社,2010:附录93.

[2]吕毅.麻杏止咳糖浆的微生物限度检查[J].华西药学杂志，2009,24(1):102-103.

[3]杨静,陈伟,马宁,等.抗脑衰胶囊微生物限度检查方法学验证[J].医学理论与实践,2009,22(1):116-117.

[4]李智勤,路东旭,李金龙.消痛贴膏微生物限度检查方法的建立[J].时珍国医国药,2009,20(2):464-465.