耐亚胺培南铜绿假单胞菌的临床分离及耐药机制分析

廉 婕 ，麦丽文 ，余治健 ，邓启文 *

1.广东医学院附属南山医院中心实验室，广东深圳 518052；2.广东医学院附属南山医院感染科，广东深圳 518052

铜绿假单胞菌（pseudomonas aeruginosa，PAE）是引起医院感染的最常见条件致病菌之一，对多种抗生素天然或获得性耐药，一直是临床关注的焦点。亚胺培南等碳青霉烯类抗生素由于抗菌谱广、抗菌活性强，已成为目前治疗多重耐药铜绿假单胞菌最有效的抗生素。但随着该类抗生素临床应用的逐渐增多，出现了大量的耐亚胺培南菌株（imipenem-resistant pseudomonas aeruginosa，IRPA），给临床治疗带来了极大困难。因此，加强对IRPA的研究，为临床有效控制其感染提供科学依据显得尤为重要。为了解深圳地区IRPA的耐药情况和耐药机制，作者收集了广东医学院附属南山医院2009年1月～2010年12月住院患者临床标本中分离的IRPA进行分析，现报道如下：

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源与质控菌株 404株铜绿假单胞菌分离于我院2009年1月～2010年12月住院部各科患者的各类临床标本（包括痰液、尿液、伤口分泌物、脓液、血液等），同一患者的同一部位连续分离的多株铜绿假单胞菌以1株计算。金属酶IMP基因阳性菌株PA987由广州医学院附属第一医院卓超教授提供。质控菌株为铜绿假单胞菌ATCC 27853，大肠埃希菌ATCC 25922，购自卫生部临床检验中心。

1.1.2 PCR引物设计 参考文献[1]设计MBL基因型IMP、VIM、GIM、SPM以及通道蛋白基因oprD2的扩增引物，由上海生物工程有限公司合成，引物序列和目的产物长度详见表1。

表1 耐药基因PCR引物序列

1.2 方法

1.2.1 细菌培养及分离 临床送检的各类标本严格按照《全国临床检验操作规程》进行细菌的分离培养。分纯后的铜绿假单胞菌用小牛血清保存至-80℃冰箱待用。

1.2.2 菌株鉴定及药敏试验方法 所有菌株均以BD Phoenix100全自动微生物分析仪鉴定到种，必要时采用梅里埃ATBExpression半自动细菌分析仪补充鉴定。药敏试验采用BD Phoenix 100革兰阴性细菌配套药敏试验复合板，包括阿米卡星、阿莫西林/克拉维斯、氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、氨曲南、头孢唑啉、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢他啶、氯霉素、环丙沙星、庆大霉素、亚胺培南、美洛培南、左氧氟沙星、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、四环素、复方磺胺、多粘菌素E，共20种抗菌药物。

1.2.3 基因扩增 采用煮沸法提取模板DNA，oprD2基因扩增条件为：95℃预变性 3 min,然后 95℃ 30 s→55℃ 30 s→72℃60 s，循环35个周期，最后72℃延长5 min；其余基因扩增条件为：95℃预变性 3 min， 然后 95℃ 60 s→55℃ 60 s→72℃60 s，循环35个周期，最后 72℃延长5 min。取PCR产物4 μg经1%琼脂糖凝胶电泳，EB染色后在凝胶成像系统中观察结果。

1.2.4 PCR产物测序 使用DNA凝胶回收纯化试剂盒（购自TaKaRa）将PCR产物割胶纯化，送至深圳华大基因测序，序列登录GenBank进行比对分析。

2 结果

2.1 IRPA的分离率

从404株铜绿假单胞菌中检出IRPA 100株，分离率为24.75%。其中大多数分离自痰液标本90株，占90.0%，其次为血液和脓液标本，均为3株，各占3.0%，分离自伤口分泌物和胆汁标本均为2株，各占2.0%。

2.2 IRPA感染者科室分布

IRPA感染者主要来自重症医学科，占31.0%，其次为呼吸内科和神经内科，分别为20.0%和16.0%，具体科室分布情况见表2。

2.3 IRPA对抗菌药物的耐药性

100株亚胺培南耐药的铜绿假单胞菌，对阿米卡星的耐药率最低，为27.0%，耐药率在30.0%～50.0%的有4种抗菌药物：头孢他啶、庆大霉素、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦；耐药率在50.0%～70.0%的有4种抗菌药物：氨曲南、环丙沙星、左氧氟沙星、头孢吡肟；对其余10种抗菌药物的耐药率均>70.0%，其中，氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、头孢唑啉和氯霉素的耐药率为100%。具体耐药情况见表3。

表2 耐亚胺培南铜绿假单胞菌的科室分布情况

表3 耐亚胺培南铜绿假单胞菌的耐药情况

2.4 MBL基因及oprD2基因检测结果

100株IRPA中，检测到IMP基因阳性1株（PA47），阳性率为1.0%，oprD2基因缺失65株（PA47为扩增阳性菌株），阳性率为65.0%，其余耐药基因（VIM、GIM、SPM）均未检出。

2.5 IMP基因测序结果

通过对PA47菌株的IMP基因PCR产物进行正向测序，经Clustal W程序分析，其核酸序列与GenBank已登陆的blaIMP-9序列（登录号：AY033653）的同源性为100%，可判定为IMP-9型基因。PA47_blaIMP在GenBank的登录号为JN107561。

3 讨论

近年来，由于化疗、放疗、免疫抑制剂及各类侵入性诊疗项目在临床的广泛开展，非发酵类病原菌引起的医院感染逐渐增多，其中铜绿假单胞菌分离量占首位（45.4%）[2]。碳青霉烯类抗生素（亚胺培南、美罗培南等）具有抗菌谱广、抗菌活性强、对β-内酰胺酶稳定性高等优点，已成为治疗IRPA感染最有效的抗生素[3]。然而，随着该类抗生素在临床治疗中的广泛应用，铜绿假单胞菌对它的耐药率也呈不断上升的趋势，中国CHINET细菌耐药性监测报道，1994～2001年中，铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药率由1994年的8.5%上升到2009 年的 30.5%[4-5]。

我院分离的铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药率为24.75%（100/404），90.0%的菌株从痰液中分离得到，表明耐亚胺培南的铜绿假单胞菌多引起呼吸道感染，是医院获得性肺炎的首位病因，这和国内外诸多相关报道一致[6-8]。

在科室分布方面，我院耐亚胺培南铜绿假单胞菌多来自ICU（31.0%），这可能与患者多为急重症或昏迷阶段，免疫力低、病程和住院时间长、有手术史以及较频繁地大量使用广谱抗菌药物，造成菌群失调，易继发感染铜绿假单胞菌，且长时间在药物选择性压力下，耐药性菌株成为优势菌群，因此，这些科室分离的耐亚胺培南铜绿假单胞菌亦多为多重耐药菌株。

药敏实验结果显示（表3），100株IRPA中，对阿米卡星的敏感性最好（73.0%），其次是哌拉西林/他唑巴坦（63.0%）、哌拉西林（59.0%）、庆大霉素（58.0%）、头孢他啶（57.0%），其余药物的敏感率均<50.0%。100株IRPA对氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、头孢唑啉、氯霉素全部耐药。同处广东地区，我院IRPA对氨基糖苷类和喹诺酮类抗生素的耐药率均<53.0%，而姚芬等[7]报道的耐药率达到95%以上，这可能跟不同医院临床用药习惯不同有关。由此可见，重视和加强细菌耐药监测，优先选用低耐药可能性的抗生素，合理应用广谱抗生素，将有助于避免IRPA引起医院感染流行。

铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制包括β-内酰胺酶的产生、外膜通透性的降低和主动外排系统的表达。金属酶（metallo-β-lactamases，MBL）是一类能够水解包括碳青酶烯类在内的所有β-内酰胺类药物的β-内酰胺酶，主要通过基因盒，整合子和转座子的形式传播。MBL包括四种类型：IMP型金属酶，已报道的超过19种；VIM型金属酶，已超过11种；SPM-1型金属酶和GIM-1型金属酶。MBL编码基因多位于整合子上，其中以IMP型和VIM型 最为常见[1]。从实验结果看，2009年1月～2010年12月收集的耐亚胺培南的铜绿假单胞菌中仅发现1株产IMP型金属酶菌株，提示产IMP型金属酶是抗菌后效应（PAE）对IMP耐药的机制之一。另外，我院检出的IMP型金属酶经分析为IMP-9型，具有该类型金属酶的铜绿假单胞菌曾在2000年于广州地区三家医院爆发流行[9]，需引起我院医院感染管理科的高度重视。

在β-内酰胺类抗生素抑菌过程中，首先必须穿透铜绿假单胞菌的外膜进入周浆间隙才能起作用，oprD2蛋白是目前所知的PAE外膜中唯一有助于抗生素通过的孔道蛋白，具有配体特异性，能形成亚胺培南的特异结合位点。一旦oprD2蛋白缺失，PAE对亚胺培南的MIC由1～2 mg/L上升至8～32 mg/L，而对其他β-内酰胺类抗菌药物影响并不大，所以碳青酶烯类抗菌药物与其他β-内酰胺类抗菌药物无交叉耐药性。一般认为，oprD2孔道蛋白的缺失是PAE对亚胺培南耐药的主要机制[10]，本实验中65%的IRPA未扩增出oprD2基因，表明大多数菌株存在oprD2基因突变，导致oprD2表达减少或不表达，这可能是我院临床分离铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的主要机制。

总之，IRPA对临床常用抗生素耐药情况非常严峻，PAE对亚胺培南耐药机制复杂，产酶、孔道蛋白oprD2基因缺失以及外排泵出机制三者可单独或同时存在。应加强临床细菌耐药性的发生和发展的监控，尽量获得细菌学证据，并根据细菌的体外药物敏感结果联合选用抗生素。另外，未来这类产酶铜绿假单胞菌可能会引起医院感染的暴发和流行，必须加强耐药监测。

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