HPLC法测定人血浆中比阿培南的浓度及其药动学研究

张爱丽，兰 婷，李穆琼，张俊娜，李晓晔

第四军医大学药学系化学教研室，陕西西安 710032

比阿培南（Biapenem）是在2-位S上具有双环三唑的1-β-甲基碳青霉烯。它对革兰阳性菌、革兰阴性菌（包括耐药的铜绿假单胞菌）、厌氧菌等均具有较强的抗菌活性；对β-内酰胺酶稳定；对肾脱氢肽酶（DHPE）的稳定性较伊米培南强；与其他已上市的碳青霉烯类品种如阿培南肾相比，毒性几乎为零，能单独给药；无中枢神经系统毒性，不会诱发癫痫发作，能用于细菌性脑膜炎的治疗[1-2]。本试验通过对注射用比阿培南的单次和多次给药药代动力学研究，了解药物在人体内吸收、分布、代谢、排泄的规律，为该药制订合理给药方案提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

1200 LC 高效液相色谱仪（Agilent），Anke TGL-16G 高速离心机（上海安亭科学仪器厂），Milli-Q plus超纯水器（美国Millipore公司），XW-80A漩涡混合仪（海门市其林贝尔仪器有限公司）。

1.2 药品及试剂

注射用比阿培南（四川赛卓药业有限责任公司，批号：080401，含量：91.77%）；5-羟基吲哚乙纯（四川赛卓药业有限责任公司，批号：M8150，内标），甲醇（色谱纯），重蒸水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 实验方法

2.1.1 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX Bonus-RP（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相：甲醇-0.03%醋酸水溶液，流速：1.0 ml/min，进样量：20 μl，紫外检测波长：300 nm，柱温：35℃，采用梯度洗脱。

2.1.2 对照品溶液的制备

精密称取比阿培南对照品10.00 mg，置于10 ml容量瓶中，用甲醇-水（5∶95，V/V）溶解，并定容至刻度，摇匀，配成1.000 mg/ml比阿培南的储备液。

2.1.3 血浆样品处理

精密量取血浆样品 200 μl，加入内标溶液 20 μl，旋涡混匀，加入100 μl 7%的ZnSO4水溶液，旋涡3 min，于16000 r/min离心10 min。吸取上清液转移至自动进样器样品瓶中，精密吸取10 μl进样，进行HPLC分析。

2.1.4 研究对象

15名男性健康受试者，体重57～68 kg，年龄30～38岁；15名女性健康受试者，体重53～61 kg，年龄29～39岁。30名健康受试者经体检证明肝、肾功能正常，心电图正常，试验前2周及试验期间未服用其他任何药物，试验期间统一饮食。

2.1.5 给药方法

临床上本品采用的给药方式为静脉滴注，故本试验采用将注射用比阿培南，并用100 ml氯化钠注射液稀释，静脉滴注，滴注时间为1.0 h。根据说明书，注射用比阿培南的正常临床治疗剂量为静脉滴注，一次300 mg，12 h一次。故本试验采用低剂量组单次静脉滴注150 mg；中剂量组单次静脉滴注300 mg，高剂量组单次静脉滴注600 mg。多次给药，每次300 mg，每日2次。

2.1.6 样品采集

2.1.6.1 单次给药 受试者于试验前1周和试验期内均勿饮用酒类和咖啡类饮料，并在试验开始前一天进入Ⅰ期临床试验病房，晚上统一清淡饮食。受试者给药间隔依取血速度而定，通常间隔5 min。于给药前0 h、开始给药后15.0、30.0、45.0、60.0 min，给药结束后 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、6.0 h取血；受试者取血顺序同给药顺序。受试者服药后应避免剧烈运动，亦不得长时间卧床。

2.1.6.2 多次给药 中剂量组10名健康受试者在单次给药结束后，继续进行多次给药，给药剂量为300 mg/次（药液稀释方法同单次给药），每日2次，连续给药5 d，每次静脉滴注时间均为1 h（第5天只给药一次）。 于第2、3、4、5天早给药前及第 5天开始给药后15.0、30.0、45.0、60.0 min， 给药结束后0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、6.0、8.0 h 前臂静脉取血，每人4 ml，置于肝素试管中，分取血浆，于-20℃保存待测。受试者服药后应避免剧烈运动，亦不得长时间卧床。多次给药后3 d对受试者进行体检复查。

2.2 实验结果

2.2.1 方法专属性

在本实验所采用的色谱条件下，注射用比阿培南的保留时间为3.9 min左右，内标保留时间为9.7 min左右。注射用比阿培南和内标峰形良好，无杂峰干扰测定。提示本方法具有较高的特异性，能准确测定血浆中的注射用比阿培南的浓度，灵敏度较高。见图1。

2.2.2 标准曲线和线性范围

图1 血浆中比阿培南的典型色谱

取1.5 ml塑料离心管数支，量取空白血浆 200 μl，置于离心管中，分别精密加入不同浓度的的比阿培南标准液，旋涡混匀，配成含比阿培南的浓度分别为0.2、0.5、1.0、3.0、10.0、20.0、50.0 μg/ml的标准含药血浆， 各血浆含 0.1 mg/ml内标20 μl，按“2.1.3”项下血浆样品的处理方法操作，制备一条标准曲线，并同时做空白样品，进行HPLC-UV分析。记录色谱图，计算比阿培南的峰面积As和内标峰面积Ai的比值f（f=As/Ai）。以峰面积比值f对血药浓度C作权重回归计算，得回归方程：f=0.0019+0.1638C（权重系数 w=1/C），r=0.9990，按上述条件测得比阿培南在血浆中的定量下限为0.2 μg/ml。

2.2.3 精密度与准确度

取1.5 ml塑料离心管数支，按“2.2.2”血浆中比阿培南标准曲线制备方法制备含比阿培南浓度分别为 0.5、5.0、40.0 μg/ml的标准含药血浆（每个浓度做5份样品）及一条随行标准曲线，按“2.1.3”项下血浆样品的处理方法操作。每天做一批及一条随行标准曲线，连续做3 d，共3批，每批每个浓度做5份样品，记录色谱图，计算比阿培南峰面积As和内标峰面积Ai的比值f，代入当天的标准曲线求得实测浓度，计算批内和批间精密度。见表1。

表1 血浆中比阿培南的精密度

2.2.4 加样回收率试验

取1.5 ml塑料离心管数支，加入空白血浆0.2 ml，旋涡混匀，配成含比阿培南的浓度分别为0.5、5.0、40.0 μg/ml的标准含药血浆，计算比阿培南加样回收率。见表2。

表2 比阿培南加样回收率试验（n=5）

2.2.5 稳定性试验

取新鲜配制的比阿培南储备液和4℃放置4 d的比阿培南储备液，以甲醇-水（5∶95，V/V）稀释至 5 μg/ml，各进行 3样本分析，采用HPLC法测定。内标（5-羟基吲哚乙酸）储备液稳定性，方法同上，稀释至10 μg/ml，各进行3样本分析，结果表明，比阿培南和内标的标准溶液在4℃存放4 d性质稳定，RSD分别为1.58%和2.66%，均小于15%。

2.2.6 血药浓度测定结果

30名健康受试者单次静脉滴注150、300、600 mg后血浆中比阿培南的浓度-时间曲线。经DAS（drug and statistics，Version 2.0）程序处理，用一室模型计算药代动力学参数。主要药代动力学参数见表3，平均血浆药物浓度-时间曲线见图2。

3 讨论

据文献[3-5]报道，本品经肝脏代谢，经尿排泄。本品在体内稳定，主要以原形药存在于血和尿中，并通过尿液排泄，其中77%为原形，24 h的尿中回收率为99.3%。因此测定血浆的比阿培南可以不必考虑到药物代谢产物的影响。比阿培南作为一种较新开发的碳青霉烯类抗生素，其血药浓度测定方法还有待完善。

图2 单次和多次静脉滴注300 mg注射用比阿培南后的平均血药浓度-时间曲线比较

表3 健康受试者单次与多次静脉滴注注射用比阿培南后药动学参数比较（，n=10）

表3 健康受试者单次与多次静脉滴注注射用比阿培南后药动学参数比较（，n=10）

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本实验采用甲醇和0.03%醋酸水溶液为流动相，与其他文献中使用C18柱相比，本实验中使用的是水性柱，通过HPLC法测定人血浆中比阿培南的浓度，可以使药品比阿培南和内标出峰迅速，灵敏度高。在该HPLC的检测条件下，血样的最低检测浓度可以达到0.2 μg/ml，可显著降低样品的测定体积，减少取样量，对进一步临床试验具有重要意义。本试验建立的人血浆中比阿培南的HPLC测定方法，其特异性、标准曲线、定量限、精密度、准确度及样品稳定性等均符合《化学药物临床药代动力学研究技术指导原则》的相关要求，适用于比阿培南药动学试验的研究。

[1]艾迪杰·巴亚斯.HPLC法测定人血浆中比阿培南的浓度[J].中国药房,2009,20(32):2517-2519.

[2]金小平,孟丽丽.比阿培南的人体药动学[J].中国医院药学杂志,2009,29(10):817-820.

[3]Kozawa O,Uematsu T,Matsuno H,et al.Pharmacokinetics and safety of a new parenteral carbapenem antibiotic,biapenem (L-627),in elderly subjects[J].Antimicrobial Agents and Chemotherapy,1998,42(6):1433-1436.

[4]Nagashima S,Kozawa O,Otsuka T,et al.Pharmacokinetics of a parenteral carbapenem,biapenem,in patients with end-stage renal disease and influence of haemodialysis [J].Antimicrob Chemother,2000,46(5):839-842.

[5]Nakashima M,Uematsu T,Ueno K,et al.Phase I study of L-627,biapenem,a new parenteral carbapenem antibiotic [J].International Journal of Clinical Pharmacology:Therapy and Toxicology,1993,31:70-76.