非水毛细管电泳内标法测定麻黄中麻黄碱的含量

2011-07-27肖宇航荆照政

中国医药导报 2011年35期

肖宇航，秦群，荆照政

1.中南大学湘雅医院药剂科，湖南长沙 410008；2.中南大学湘雅医院中心实验室，湖南长沙 410008

麻黄碱（ephedrine）是中药麻黄的主要有效成分，具有松弛支气管平滑肌、扩张支气管、收缩血管、升高血压及兴奋中枢等作用。麻黄碱的测定方法很多，除容量分析法外，还包括薄层扫描法[1]、高效液相色谱法[2-4]、气相色谱法[5]、电位滴定法以及导数光谱[6]、双波长[7]等各种紫外分光光度法。目前高效毛细管电泳法已广泛应用于中药成分的分析[8]，相比以上所述分析方法，它具有分析周期短，柱子不易污染，消耗试剂少，费用低的优点，特别适用于快速检验。目前也有毛细管电泳方法用于测定麻黄碱的报道[9-10]。本文采用非水毛细管电泳内标法定量测定麻黄碱，选择了合适的内标和非水电泳液，优选了仪器工作参数，简化了样本预处理操作，为麻黄碱的测定提供了一种简便、快速、定量可靠的方法，可用于医学研究样品和药材中麻黄碱的测定。

1 仪器与试药

System P/ACE 5010型毛细管电泳仪紫外检测器（Beckman 公司），未涂层熔融石英毛细管（47 cm×75 μm）（河北永年光导纤维厂），小型摇摆式中药粉碎机（浙江温岭市奥力中药机械有限公司），60目钢筛（浙江上虞五四纱筛厂），TGL16型台式高速冷冻离心沉淀机（湖南仪器仪表厂），VC130PB型超声液体破碎仪（美国SONICS＆MATERIALS公司），WH-2微型旋涡混合仪（上海沪西分析仪器厂）。

麻黄碱标准品（SIGMA 公司，批号：Lot-17E6749），品红（上海沪峰生化试剂有限公司，批号：061018-2），草麻黄（山西大同），甲醇为色谱纯，其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的配制

2.1.1 电泳缓冲液的制备精密称取1.1402 g醋酸铵和1.2305 g醋酸钠，用甲醇溶解并精确定容至500 ml（pH 7.0），混匀后，4℃保存备用。

2.1.2 内标溶液的制备精确称取10.0 mg品红，置于10 ml容量瓶内，用电泳缓冲液定容到10 ml（1 g/L），然后取0.5 ml置于10 ml容量瓶内，用电泳缓冲液定容到10 ml，混匀密封，得浓度为0.05 g/L的内标溶液，4℃保存备用。

2.1.3 对照品溶液的制备精密称取盐酸麻黄碱标准物10.0 mg置于10 ml容量瓶内，用电泳缓冲液定容（浓度为1 g/L），混匀后取1 ml于5 ml玻璃容量瓶内，用电泳缓冲液定容到5 ml（浓度为 0.2 g/L），混匀密封，4℃保存备用。

2.1.4 样品溶液的制备称取草麻黄干燥草质茎50 g于40℃烤12 h，然后粉碎成能过60目钢筛的粉末，称取100 mg粉末置于10 ml具塞玻璃管中，加入2 ml 1%HCl，40℃电热恒温水浴箱中浸泡12 h。每隔3 h超声提取1 min（勿使溶液发热），2000 r/min离心10 min，取1 ml上清液置1.5 ml EP管中，室温放置至样品液全干（约2 h）。精密量取1 ml电泳缓冲液置EP管内，并置于微型旋涡混合仪上使沉淀充分溶解后，12000 r/min离心10 min，取100 μl上清液置于 0.5 ml塑料离心管内（麻黄碱含量大于0.2%的样品，需要酌情稀释样品液），加入10 μl内标溶液，混匀，装样进行电泳分析。

2.2 电泳条件

工作电压为20 kV，压力进样为10 Pa×10 s，电泳方向从正极到负极，柱温为25℃，检测波长为210 nm；运行缓冲液30 mmol／L醋酸铵和醋酸钠甲醇缓冲液（pH 7.0）；两次运行之间，必需用0.1 mol/L的NaOH溶液冲洗柱子3 min，再用醋酸铵甲醇溶液冲洗柱子3 min。各类型非水溶液在使用之前均用0.45 μm微孔滤膜滤过。

在上述测定条件下，记录麻黄碱标准品和麻黄样品测定的NACE色谱图。见图1。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察取1 g/L麻黄碱对照品储备液适量，置于1.5 ml塑料离心管内，置于室温至样品液全干，用电泳缓冲液稀释，分别制成浓度为200.000、100.000、50.000、25.000、12.500、6.250和3.125 mg/L的对照品溶液。各取100 μl对照品溶液，分别加入10 μl内标溶液，混匀，进行标准曲线的测定。以标准物浓度（Y）对标准物峰高与内标物峰高比值（X）进行回归分析，得麻黄碱回归方程：Y=0.02775X+0.00129，相关系数r=0.9940。

图1 NACE色谱图

2.3.2 最低检出浓度试验取1 g/L的盐酸麻黄碱对照品溶液适量，置于1.5 ml塑料离心管内，置于室温至样品液全干，精密加入1 ml电泳缓冲液，置于微型旋涡混合仪上充分混匀，进样。当检测器显示的OD210值稳定后，启动电泳仪，在麻黄碱快去峰时，提前10 s随机记录麻黄碱在保留时间（tR）里的信噪吸收（absorbace，AU）最大值，按信噪比（S/N）约等于3，测得麻黄碱最低检出浓度为2 mg/L。

2.3.3 精密度试验取0.1 g/L的麻黄碱对照品溶液100 μl，加入10 μl内标溶液，混匀，连续测定6次，测定结果显示RSD为2.05%，表明仪器精密度良好。选用1个样品，按样品处理程序进行操作，处理6份分别测定，测定结果显示，RSD为3.17%，表明本方法精密度良好。

2.3.4 加样回收率试验分别选用含麻黄碱低和高的样品（含量约为0.1%和0.5%），每一个样品制成2份，每份取100 mg粉末置于10 ml玻璃管中，其中一份准确加入与样品含量相当的麻黄碱对照品（即第一组加入0.1 g/L麻黄碱1 μl，第二组加入0.5 g/L麻黄碱1 μl，），将其作为已知标准值的试验样品。而另一份样品作为空白对照样品。分别按样品处理程序进行操作，然后对4组单样进行测定，每份单样测定6次，结果显示本方法测定麻黄碱的回收率为97.47%～101.85%。测定结果见表1。