石决明清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基活性的研究

王志力 ，梁红宝 ，伍久林 ，陈 立 ，张其清 ,2*

1.福州大学生物和医药技术研究院，福建福州 350002；2.中国医学科学院生物医学工程研究所，天津 300192

石决明为海产鲍科软体动物鲍鱼（abalone）的贝壳，是一种名贵的动物类中药，具有平肝潜阳、清肝明目的功效。在水产养殖业，鲍鱼是一种重要的经济软体动物[1]，主要分布在东亚地区[2]，中国作为最大的鲍鱼生产国，每年要产生大量的鲍鱼壳，以致形成石决明药材产量过剩的局面。因此，有必要开展鲍鱼壳高附加值生物活性提取物方面的研究，填补该类中药开发研究领域的空白。

石决明同其他贝壳类物质一样，含有大量的碳酸钙、多种微量元素[4-5]和蛋白质成分等有机物。目前，对石决明的研究多集中在其成分、结构及两者的相关性方面，而对具有生物活性的药效成分的研究却鲜有报道。抗氧化作用是防治多种疾病的重要药效机制之一。本文采用生化分离方法对石决明成分进行分离，并通过对各成分体外清除DPPH自由基活性的研究，发现石决明含有多种抗氧化活性成分，为阐释石决明药理学作用机制提供了依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器和设备

TP-114电子天平（美国Sartorius Denver公司），D8C真空泵（德国Ernst Leybold公司），旋转常温浓缩仪（日本EYELA公司），Primo R台式冷冻离心机（美国Thermo Scientific公司），蛋白电泳仪（美国GE公司），离子交换层析系统（日本岛津公司），Aquapro超纯水机（重庆颐洋企业发展有限公司），UV-1600紫外分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）。

1.2 材料和试剂

闽产杂色鲍 （haliotis diversicolor reeve）（来自福建谊来鲍鱼制品有限公司），1，1-二苯基-2-三硝基苯肼[1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical-2，2-diphenyl-1-（2，4，6-trinitrophenyl）hydrazyl，DPPH]（由 Alfa Aesar公司提供），羧甲基葡聚糖凝胶C-25（CM-Sephadex C-25）（美国General Electric公司生产），蛋白Marker（美国Fermentas公司生产），其余试剂均为国产分析纯。

2 方法与结果

2.1 样品处理

将杂色鲍贝壳剥离后用去离子水清洗干净，常温鼓风干燥至恒重，用粉碎机把鲍鱼壳粉碎成200目以上的粉末，称取200 g，加入5%稀酸溶液500 ml，4℃搅拌至没有气泡产生，用稀碱溶液调节pH值至7.0，过滤，取滤液，低温高速离心15 min，取上清液，低压浓缩蒸发至50 ml，低温透析24 h，透析液4℃冰箱保存备用。

2.2 离子交换色谱分析

用CM-Sephadex C-25离子交换色谱系统分离“2.1”项下制备的石决明提取液，洗脱条件为：0～1.0 mol/L溶解在20 mmol/L PBS（pH 8.0）缓冲液中的NaCl溶液线性梯度洗脱IEC上样层析柱，流速为1.0 ml/min，紫外吸收波长为280 nm光密度（OD280nm）检测，自动收集器每管3 ml收集洗脱液，24 h低温透析，4℃保存备用。共制备60管。

2.3 蛋白成分检测

[6]的方法，SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳分析“2.2”项下序号为 18、20、25、34、38、45 收集管的蛋白组分（依据“2.2”项下各管OD280nm值，OD280nm值较大者入选），空白对照用去离子水代替IEC分离样品，浓度为12%聚丙烯酰胺凝胶作为分离胶，考马斯亮蓝R-250溶液染色。

2.4 DPPH·清除活性分析

参考文献[7]的方法，对“2.2”项下各管收集物的DPPH自由基清除能力进行检测，反应体系包括：0.5 mg/ml样品溶液 0.2 ml，2.0×10-4mol/L DPPH 溶液 2.0 ml，加超纯水至反应总体积为4 ml。37℃水浴条件下避光反应30 min，空白实验以等体积无水乙醇代替DPPH溶液，对照以等体积去离子水代替样品溶液，检测波长为517 nm。DPPH·清除率计算依据公式：

其中：Ax为加入样品的吸光度；Axo为样品的吸光度；Ao为未加样品的吸光度。

2.5 石决明样品处理及IEC色谱分析

石决明溶解于稀酸溶液，可观察到溶液变为黄褐色，除去不溶性物质后，经过离子交换层析，在280 nm处测定各管收集液光密度值，得到双峰洗脱曲线，第一个峰（对应第25管）洗脱时间长，峰型为不对称宽峰，推测该峰包含多种成分。第二个峰（对应第38管）洗脱时间短，峰型为尖峰，第38管分离液OD280nm为1.875，位于峰尖位置，可能是一种组成比较简单的组分。见图1。

图1 CM-Sephadex C-25离子交换层析梯度洗脱石决明提取物色谱

2.6 蛋白成分分析

SDS-PAGE电泳结果表明，与色谱峰相对应的第25和第38管溶液均显示出明显蛋白条带，而其余收集组分对应的条带明显减弱，第45管与对照组都没有显示出明显条带，所有蛋白条带均集中在18.4～25.0 kDa分子量标准Marker蛋白条带之间，说明经过IEC分离得到主要蛋白组分的分子量在18.4～25.0 kDa 之间，与 Michenfelder[8]从红鲍（haliotis rufescens）贝壳中获得的矿化连接蛋白AP24分子量相近。见图2。

图2 石决明分段分离组分SDS-PAGE电泳

2.7 DPPH自由基清除能力测定

清除DPPH自由基活性测试结果表明，石决明溶液经过IEC色谱分离后的第18、38、55管以后各分离样品均具有较高DPPH自由基清除能力，第60管以后样品的DPPH自由基清除率能达到45%以上。第38管样品在280 nm处有最大吸收，而且蛋白电泳条带明显，说明石决明可能含有具有抗氧化活性的蛋白组分。见图3。

图3 石决明提取物对DPPH自由基清除率

3 讨论

石决明是临床常用的中药之一，由角质层、棱柱层和珍珠层组成，其有机组分主要存在于珍珠层。贝壳珍珠层与珍珠成分非常相似，而后者水提液能显著提高小鼠体内过氧化物歧化酶活性，降低过氧化产物水平[9-10]。有文献报道，珍珠层成分具有很高的活性氧自由基清除活性[11]，与本研究结论相近，推测贝壳珍珠层与珍珠具有相似的活性氧自由基清除活性成分，可以作为昂贵药用珍珠的理想替代品，具有广阔的应用前景。

本研究根据石决明酸溶性水提液组分在不同离子浓度条件下对羧甲基葡聚糖凝胶吸附力的不同，通过离子交换色谱，获得了含有不同蛋白成分的分离液，经过SDS-PAGE电泳分析发现，各收集管分离物的主要蛋白分子量均在18.4～25.0 kDa之间，而且含量与280 nm处光密度测量值呈正相关。IEC色谱分离液DPPH自由基清除能力结果表明，除部分组分的清除能力与蛋白含量显著相关外，其余样品与蛋白含量的多少不存在相关性。具有DPPH自由基高清除活性的第18、50管及以后各管组分，在280 nm处没有强吸收，也没有明显的蛋白电泳条带，说明石决明除含有抗氧化蛋白成分外，还存在可以清除DPPH自由基的其他高活性物质。因此，抗氧化药效成分可能是石决明药理学作用的物质基础，石决明抗氧化作用研究为进一步揭示贝壳类中药的药用机制提供了科学依据。

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