羊膜在青光眼滤过术中的应用

吴 兰

青光眼是一种发病迅速、危害性大、随时可能导致患者失明的常见疑难性眼病。青光眼最核心的问题是视神经病变，无论哪一类的青光眼都具有共同的视网膜视神经损害这一病理结局。视神经由很多神经纤维组成，当眼内压增高时，可导致神经纤维损害，引起视野缺损。如果视神经受损严重，可导致患者失明。流行病学研究资料表明，青光眼在全球是仅次于白内障的导致视力丧失的主要原因，也是我国主要的不可逆性致盲眼病。因此，尽早对患者进行青光眼的检查、诊断和治疗是防治视神经损害和失明的关键。我们自2007年9月至2009年9月将羊膜应用于青光眼的滤过手术中，取得了较好的疗效，现报告如下。

1 材料和方法

1.1 临床资料

以2007年9月至2009年9月，在湖北民族学院附属医院眼科收治的青光眼患者为研究对象，共40例48只眼。其中女性22例27只眼，男性18例21只眼。平均年龄为53岁。将患者随机分成移植组（26只眼）和对照组（22只眼）。移植组包括急性闭角型青光眼12只眼，慢性闭角型青光眼8只眼，原发性开角型青光眼6只眼。对照组包括急性闭角型青光眼9只眼，慢性闭角型青光眼6只眼，原发性开角型青光眼7只眼。

1.2 羊膜取材及保存

选用羊水澄清的足月剖宫产娩出的无污染新鲜胎盘羊膜，经术前检查，产妇HbsAg阴性，无巨细胞病毒感染，人免疫缺陷病毒抗体及梅毒血清特异性抗体均阴性。将胎盘置于层流工作台中，用含50μg/ml青霉素、50μg/ml链霉素、100μg/ml新霉素和 2.5μg/ml两性霉素B的平衡盐液平衡盐溶液（balanced salt solution，BSS）反复冲洗，以去除羊膜表面的凝血块，然后应用钝性分离将羊膜与绒毛膜组织分开（通过两者的潜在间隙），去除羊膜基底面残存的绒毛膜和血管组织，用上述BSS冲洗后，将羊膜平铺并粘贴于手术巾的纸体上，羊膜的粗糙面与纸的粗糙面相贴，上皮面向上。根据需要剪成一定大小的圆形或方形小块，置于已灭菌的装有DMEM甘油液（DMEM∶甘油=1∶1，体积比）的小瓶中，-80℃冰冻保存，使用前室温解冻。

1.3 手术方法

1.3.1 术前准备：1.术前常规检查视力、眼压、视野、房角、角膜、前房深度、晶状体、眼底等。2.术前针对不同类型的患者行常规治疗，如：缩瞳、降眼压、抗炎等。术前尽量将眼压降至30 mmHg（1 KPa≈7.5 mmHg）以下，其中有7只眼顽固性眼压升高，于术前15分钟快速静脉点滴20%甘露醇注射液250 ml。3.术前术眼常规行泪道冲洗和结膜囊冲洗。

1.3.2 手术步骤：所有患者均由同一医生在眼科手术显微镜下完成。移植组：局麻成功后，行标准的小梁切除术，先做以穹窿部为基底的结膜瓣，电凝止血，然后用巩膜隧道刀制作大小为4 mm×4 mm，厚度为1/2～2/3巩膜厚度的巩膜瓣，颞侧近角膜缘行前房穿刺，释放少量房水，切除大小约1.5 mm×2 mm含小梁组织在内的巩膜内瓣，然后完成虹膜周边切除。接着将术前已室温解冻的羊膜移植片修剪，使其和巩膜瓣成形状相似但稍大于巩膜外瓣2～3 mm，将其上皮面朝上平铺于巩膜瓣下，多出的羊膜向四周平铺于结膜瓣和巩膜之间，用10-0尼龙线间断缝合巩膜瓣，间断缝合结膜下筋膜3针，最后缝合结膜瓣。术毕，球结膜下注射妥布霉素2万单位+地塞米松2.5 mg。结膜囊涂抗生素眼膏。术眼绷带加压包扎。对照组：除术中未移植羊膜外，其他步骤同移植组。术后行常规预防感染、止血、抗炎等对症治疗。

1.4 观察内容

于术后第1天开始每天检查视力、眼压、角膜、前房、晶状体及滤过泡的情况并记录，术后1周出院，出院后1个月内每周复查1次，而后每月复查1～2次，半年后每3个月复查1次。

1.5 疗效判定

1.5.1 手术疗效：疗效判定标准：（1）完全成功：术后眼压在不用抗青光眼药物的情况下眼压6～21 mmHg；（2）条件成功：术后在加用抗青光眼药物的情况下眼压在 6～21 mmHg；（3）失败：术后长期眼压＜6 mmHg，或用降眼压药物后眼压＞21 mmHg，需再次于术者。于术后1年进行疗效评价。

1.5.2 滤过泡：参照Kronfeld分型，I型：微小囊型；II型：弥漫扁平型；III型：缺如型；IV型：包囊型。I，Ⅱ型为功能型，Ⅲ，Ⅳ型为非功能型。

1.5.3 视力评价：于术后半年进行视力评价。评价标准为：（1）视力提高：与术前相比，视力提高1行以上；（2）视力不变：视力与术前一样；（3）视力下降：与术前相比，视力降低1行以上。

1.6 统计学分析

应用SPSS 11.0统计软件包进行统计学处理。采用卡方检验，以P＜0.01为差异有统计学意义。

2 结果

术后随访6个月至3年，平均2.5年。比较移植组及对照组的疗效、滤过泡、视力、并发症情况，具体见下。

2.1 疗效比较

移植组中完全成功18只眼（69%），条件成功5只眼（19%），失败3只眼（12%），总有效率为 88%；对照组中完全成功12只眼（54%），条件成功5只眼（23%），失败5只眼（23%），总有效率为 77%。2组差异有统计学意义（P＜0.01）（表 1）。

2.2 滤过泡形态比较

术后早期（3个月以内），移植组滤过泡较对照组明显隆起、弥散。术后6～24个月，移植组非功能性滤过泡（Ⅲ、IV型）有2只眼（7.69%），对照组则有4只眼（18.18%），2 组间差异有统计学意义（P＜0.01）。

表1 移植组与对照组疗效比较（眼数，%）

2.3 术后视力变化比较

移植组和对照组视力提高百分比分别为69.23%和31.03%，2组间差异有统计学意义（P＜0.01）（表 2）。

表2 移植组与对照组术后视力变化比较（眼数，%）

2.4 移植组与对照组术后并发症比较

移植组和对照组术后并发症分别为10只眼和11 只眼，2 组间差异无统计学意义（P＞0.05）（表 3）。

表3 移植组与对照组术后并发症比较（眼数）

3 讨论

目前，手术是治疗青光眼的一种重要手段，其中小梁切除术是治疗闭角型青光眼和开角型青光眼的主要手术方式。常见的青光眼滤过性手术失败主要有以下几种原因：（1）手术本身对机体造成创伤，引起成纤维细胞增殖，形成瘢痕堵塞滤过道，这是手术失败的最直接原因。（2）手术后因为血—房水屏障受到破坏导致眼内血浆纤维蛋白渗出，血流减速及炎性因子的刺激使纤维蛋白极易凝结成块并沉积，形成阻塞物而使房水引流受阻。（3）术后成纤维细胞增殖并分泌黏蛋白及胶原，二者黏合形成胶原纤维，并且相互交叉连接；手术损伤处的结膜下及滤过道部位出现新生毛细血管，这两个因素促使瘢痕组织成熟，导致滤过道闭塞。

1989年Kozlov应用由猪巩膜制得的微孔交联胶原条作为房水引流物联合巩膜深层切除，首次开创了青光眼的引流条植入术，而且将引流条在滤过道内留置了9个月以上的时间，保持了滤过道的通畅。但是另一问题又出现了：作为异体物质的引流条长期留置在体内可能导致严重的免疫排斥反应。后来相继有Molteno植入物、Baerveldt植入物、Ahmed青光眼阀等应用于难治性青光眼的治疗，术后效果和并发症均有不同的报道〔1-2〕，但是因为各种引流装置价格昂贵，难以在广大患者中尤其是发展中国家广泛推广使用。

自从1912年有学者首次报道用羊膜移植治疗修复体表损伤后，目前已有大量羊膜移植用于眼表疾病的相关临床研究及实验报道〔3-5〕。羊膜的生物学特性包括以下方面：（1）促进上皮生长：羊膜基底膜与眼表上皮基底膜组织成分相似，可以促进上皮细胞的黏附移行，诱导上皮分化。羊膜本身可以表达如表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、角质细胞生长因子（keratinocyte growth factor，KGF）、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）等多种因子，刺激上皮细胞形成〔6〕。 （2）抑制炎症：通过反转录PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR）和免疫组化，发现羊膜上皮和间质细胞可以表达多种抗炎蛋白。羊膜能抑制白细胞介素的表达〔7〕，诱导多核白细胞凋亡、降低角膜基质金属蛋白酶1，2，9的表达，从而减轻角膜炎症反应，抵抗角膜溶解。（3）抑制纤维化：羊膜可抑制转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）的 mRNA 表达，使由 TGF-β 通路介导的肌成纤维细胞分化受到抑制，起到抗瘢痕形成的作用。（4）抑制新生血管：羊膜中含有新生血管抑制因子，能抑制血管内皮细胞的迁移和生长。羊膜上皮和间质细胞可以表达多种抗血管形成蛋白，能抑制新生血管组织生长，减少新生血管形成。羊膜的生物学特性恰好符合既不引发移植排斥反应又能抑制纤维化的组织来减少青光眼术后瘢痕的形成，而且羊膜取材方便，价格低廉，充分表明羊膜移植适用于抗青光眼治疗的可行性。 国内杨静〔8〕、翼建平〔9〕等眼科医生利用羊膜的上述特性，把羊膜应用于小梁切除和非穿透小梁切除术中取得很好的临床效果。用羊膜代替生物胶，使手术成本下降；用羊膜代替抗代谢药物可减少对眼部的不良作用。

临床研究以及基础研究都证实羊膜移植能有效降低眼压及防止纤维增生。羊膜在青光眼手术治疗中的可能降压机理有：（1）羊膜组织中无血管、无淋巴，排斥反应轻微，几乎无免疫原性。羊膜通过抑制各种炎症细胞HLA-DR抗原的表达〔10〕能够有效地降低局部排斥反应的强度，同时也通过减少局部组织中的辅助性T淋巴细胞的表达抑制排斥反应。（2）抗炎症作用：羊膜中含有的 EGF、TGF-β、KGF、HGF、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、白细胞介素 10（interleukin 10，IL-10）等细胞因子，可以促进多形核中性粒细胞的凋亡，而炎症反应中主要参与者就是多形核中性粒细胞，它的凋亡直接减轻了炎症反应，抑制了炎症的加重。较多的临床资料显示，羊膜在术后10～30 d能够自行溶解吸收，使炎症反应逐渐消退〔11〕。同时起作用的还有溶酶体，它能清除凋亡的多形核中性粒细胞，而羊膜的上皮恰恰具有合成并释放溶酶体的功能。（3）羊膜具有抗新生血管形成，促进上皮化增生的作用。（4）抗纤维化作用：实验证明新鲜羊膜在家兔小梁切除术中可以通过抑制成纤维细胞生长因子的表达，进而抑制成纤维细胞形成而起到防止滤过泡粘连、滤过道瘢痕形成的作用〔12〕。羊膜含整合素层、粘连蛋白及Ⅳ型胶原等多种成分〔13〕，能下调TGF-β信号传递，从而抑制成纤维细胞增殖。动物研究结果表明，羊膜植入手术后功能性滤过泡比率较大。术后2周时 bFGF 极少，纤维增殖仍不明显〔14〕。有学者〔15〕也指出羊膜与抗代谢药丝裂霉素C在抑制成纤维细胞增殖方面都具有显著性作用（P＜0.01）。

我们采用临床随机对照的研究方法共观察治疗青光眼40例48只眼，其中26只眼术中移植了羊膜，另外22只眼作为对照，平均随访30个月，结果表明：移植组的手术成功率、视力提高情况好于对照组（P＜0.01），而非功能性滤过泡发生率则明显低于对照组。因此我们认为小梁切除术+羊膜移植术的临床效果好，并发症少，是治疗青光眼的有效方法之一。

[1]Grueterich M，Espana E，Tseng SC.Connexin 43 expression and proliferation of human limbal epithelium on intact and denuded amniotic membrane[J].InvestOphthalmolVisSci，2002，43（1）：63-71.

[2]Kobayashi A，Takahim M，Yamada A.Fomix and conjunctiva reconstruction by amniotic membrane in a patient with conjunctival mucos associated lymphoid tissue lymphoma[J].Jpn J ophthalmol，2002， 4（3）：346-348.

[3]Barabino S，Rolando M，Bentivoglio G，et al.Role of amniotic membrane transplantation for conjunctival reconstruction in ocular cicatrcial pemphigoid[J].Ophthalmology，2003，110（3）： 474-480.

[4]Solomon A，Pires RT，Tseng SC.Amniotic membrane transplantation after extensive removal of primary and recurrent pterygia[J].Ophthalmology， 2001， 108（3）： 449-450.

[5]Tseng SCG，Prabhasawat P，Lee SH.Amniotic membrane transplatation for conjunctival surface reconstruction[J].Am J Ophthalmol，1997， 124（6）： 765-774.

[6]李 线，丁 琦，陈 剑，等.新鲜羊膜移植术对角膜新生血管抑制作用的实验研究[J].眼科新进展，2001，21（6）：407-409.

[7]陈家祺，周世有，黄 挺，等.新鲜羊膜移植治疗严重的急性炎症期及瘢痕期眼表疾病的临床研究[J].中华眼科杂志，2000，36（1）：13.

[8]杨 静，张 纯，王 薇，等.羊膜植入技术在青光眼手术中的应用[J].中国实用眼科杂志，2003，21（12）：891.

[9]翼建平，张秀兰，叶天才，等.非穿透性滤过手术联合羊膜移植的实验研究[J].中国实用眼科杂志，2002，20（3）：203.

[10]Demir T，Turgurt B，Akyol N，et al.Effect s of amniotic membrane transplantation and mitomycin C on wound heNing in expefimental glaucoma surgery[J].Ophthalmologica， 2002， 216（6）： 438.

[11]Roizumi NJ， Inatomi TJ， Sotozono CJ， et a1.Growt h factor mRNA and protein in preserved human amniotic membrane[J].Current Eye Research， 2000，220（3）：173.

[12]栗印兰，李静敏.羊膜植入对兔眼仿青光眼术后滤过区瘢痕影响的实验研究[J].大连医科大学学报，2009，31（4）：295.

[13]John T.Human amniotic membrane transplantation：past，present and future[J].Ophthalmol Clin Nort h Am， 2003，16（1）：43.

[14]王 峰.青光眼滤过术联合羊膜移植治疗青光眼疗效观察.中外医学研究[J].2010，25（8）：50.

[15]DiSalvo CV，Zhang D，Jacobberger JW.Regulation of NIH-3T3 cell G1 phase transit by serum during exponential growth[J].Cells Prolif，1995， 28（6）：511.