微生物细胞脂肪酸的组成分析

柳志杰，章 辉，周 利，花 强

(华东理工大学 生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237)

微生物油脂又称单细胞油脂，是微生物在一定条件下产生并储存于菌体内的甘油脂，其脂肪酸组成以C16、C18系脂肪酸(如硬脂酸、油酸和亚油酸)为主。将微生物油脂进行酯化反应，可以获得生物燃料[1，2]。脂肪酸含量及组成可以作为微生物分类鉴定的指标[3～5]，相对于抗原检测和杂交，具有不需要探针的优势；在代谢组学研究中，微生物细胞脂肪酸组成及含量的动态变化可以反映细胞的代谢状态[6]。因此，微生物脂肪酸组成及含量分析具有重要的意义。

文献报道细胞内油脂总含量的分析方法有苏丹黑B染色法[7]、磷酸香草醛法[8]以及尼罗红染色法[9]，但这些方法均无法分析细胞油脂脂肪酸的组成。而气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)[10]可以直接通过图库检索得到样品的信息，不需要再通过标样比对进行样品的确认，分析方便，具有普遍的应用意义。因此，作者在此采用GC-MS法，对油脂酵母皮状丝孢酵母的油脂分布以及脂肪酸组成进行分析，拟为微生物细胞脂肪酸的分析应用提供新途径。

1 实验

1.1 菌株与试剂

油脂酵母皮状丝孢酵母(Trichosporoncutaneum)，自行保藏。

三氟化硼溶液、癸酸(C10：0)，Sigma公司；其它试剂均为分析纯。

1.2 培养基

合成培养基(g·L-1)：葡萄糖12.0，(NH4)2SO40.4，KH2PO43.0，MgSO4·7H2O 0.5，L-组氨酸0.03，L-亮氨酸0.125，L-蛋氨酸0.025，尿嘧啶0.04，微量元素溶液1 mL，维生素溶液1 mL。

微量元素溶液(g·L-1)：EDTA 15.0，ZnSO4·7H2O 4.5，CoCl2·6H2O 0.3，MnCl2·4H2O 1.0，CuSO4·5H2O 0.3，CaCl2·2H2O 4.5，FeSO4·7H2O 3.0，NaMoO4·2H2O 0.4，H3BO31.0，KI 0.1。

维生素溶液(g·L-1)：D-生物素0.05，泛酸钙1.0，烟酸1.0，维生素B11.0，维生素B61.0，对氨基苯甲酸0.2，肌醇25。

1.3 培养条件

将对数生长中期的种子液接种到装有0.8 L培养基的1.5 L发酵罐中，于30 ℃、480 r·min-1培养，通气量1.5 vvm。发酵过程中的溶氧、pH值、尾气等数据全部使用Biostar软件进行在线采集。

1.4 微生物细胞油脂的提取[11]及脂肪酸组成分析

采用酸热-有机溶剂萃取法提取微生物细胞油脂：离心收集菌体；向菌体中加入适量4 mol·L-1HCl溶液，浸泡30 min，煮沸10 min；置于冰上速冷，孵育；加入4 BV的甲醇-氯仿(1∶2，体积比)溶液，混合，封口，置于摇床中于180 r·min-1萃取30 min；12 000 g离心5 min，取下层有机层；重复萃取1次；将所收集的有机溶剂过滤，旋转蒸发去除有机溶剂，称重。

将油脂溶解于3 mL 0.5 mol·L-1氢氧化钾-甲醇溶液，75 ℃水浴20 min；加入3 mL 14%三氟化硼溶液，75 ℃水浴20 min；加1 mL饱和氯化钠溶液，再加入适量癸酸作为内标，离心取上清，在氮气下吹干，用正己烷定容；过滤，用GC-MS法分析脂肪酸组成。

GC-MS分析条件：采用Agilent 6890-5975型气质联用仪。气相色谱柱：HP-5MS (30 m×0.25 mm，0.25 μm)；升温程序：180 ℃保留2 min，以5 ℃·min-1升温至250 ℃；载气(氦气，纯度≥99.996%)流速1 mL·min-1；进样量0.2 μL；不分流进样；进样口温度250 ℃，离子源温度230 ℃；-70 eV轰击；质谱仪扫描范围70～560m/z；溶剂延迟1.5 min。

1.5 分析测试

(1)细胞干重的测定：取一定量发酵液于4 ℃、12 000 g离心10 min，用去离子水洗2次后置于85 ℃烘箱中烘至恒重，称重。

(2)葡萄糖浓度的测定：采用HPLC法。Agilent 1200型高效液相色谱仪，配示差折光分析检测器；色谱柱为Spherisorb NH2柱(0.46 cm× 25 cm，7 μm)；流动相为乙腈-水(80∶20)；流速1 mL·min-1；检测器温度 40 ℃，柱温40 ℃。

(3)氮源浓度的测定：采用苯酚-次氯酸钠法[12]。

2 结果与讨论

2.1 菌体生长及油脂积累情况(图1)

图1 皮状丝孢酵母菌体生长及油脂积累情况

由图1可以看出，皮状丝孢酵母的生长可以分为两个时期：菌体生长期和油脂积累期。0～24 h，菌体快速生长，细胞内油脂含量基本不变，为菌体生长期；24 h后，氮源消耗完，菌体生长变慢，细胞内油脂含量不断升高，60 h时，葡萄糖耗尽，油脂含量达到最大值31%，为油脂积累期。

2.2 菌体细胞油脂脂肪酸的组成分析

皮状丝孢酵母体内积累的油脂经酸热-有机溶剂萃取、甲酯化处理后进行GC-MS分析，得到的总离子流图见图2。

1.Decanoic acid，methyl ester(internal standard) 2.9-Hexadecanoic acid，methyl ester，(Z) 3.Hexadecanoic acid，methyl ester 4.9，12-Octadecadienoic acid (Z，Z)-，methyl ester 5.9-Octadecenoic acid (Z)-，methyl ester 6.Octadecanoic acid，methyl ester

由图2可以看出，脂肪酸甲酯得到了很好的分离。菌体细胞油脂脂肪酸组成主要为油酸(C18：1)、软脂酸(C16：0)、棕榈油酸(C16：1)、硬脂酸(C18：0)和亚油酸(C18：2)。

对皮状丝孢酵母油脂脂肪酸的积累及组成进行分析，结果见图3和图4。

图3 皮状丝孢酵母油脂脂肪酸的积累情况

图4 皮状丝孢酵母油脂脂肪酸的组成

由图3和图4可以看出，菌体细胞在发酵过程中主要积累油酸(C18：1)，其次为软脂酸(C16：0)和棕榈油酸(C16：1)，硬脂酸(C18：0)积累速率较慢，亚油酸(C18：2)基本不积累。脂肪酸组成变化：软脂酸(C16：0)、棕榈油酸(C16：1)、硬脂酸(C18：0)所占比率基本不变，油酸(C18：1)所占比率升高，亚油酸(C18：2)所占比率降低。通过发酵，最终得到的皮状丝孢酵母油脂脂肪酸组成为：油酸(C18：1)64.80%、软脂酸(C16：0)19.90%、棕榈油酸(C16：1)10.94%、硬脂酸(C18：0)3.72%、亚油酸(C18：2)0.56%。

3 结论

对油脂酵母皮状丝孢酵母细胞油脂进行提取，并应用GC-MS对其脂肪酸组成进行了分析。结果表明，菌体的代谢状态分为两个时期：菌体生长期和油脂积累期；菌体细胞主要积累油酸(C18：1)、软脂酸(C16：0)和棕榈油酸(C16：1)；通过发酵，最终得到的皮状丝孢酵母油脂脂肪酸组成为：油酸(C18：1)64.80%、软脂酸(C16：0)19.90%、棕榈油酸(C16：1)10.94%、硬脂酸(C18：0)3.72%和亚油酸(C18：2)0.56%。GC-MS可以很好地用于脂肪酸甲酯的分析，具有普遍的应用意义。

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