超声法提取石榴皮多酚的研究

2011-07-26汝绍刚赵文英朱庆书

化学与生物工程 2011年10期

汝绍刚，赵文英，崔波，朱政，朱庆书

(1.青岛科技大学化工学院，山东青岛 266042；2.枣庄职业学院，山东枣庄 277800)

石榴多酚是一类具有多酚羟基化合物的总称，主要存在于石榴皮中，含量约为其干质量的10%～20%，具有抗氧化、抗衰老、抗菌、降血压和预防心脑血管疾病等多种生理和药理活性[1]，在食品、医药和日用化学品等领域显示出巨大的应用价值。

传统中药存在有效成分含量低、杂质多、质量不稳定的缺点，这主要是由于提取工艺不稳定、提取效率低引起的。因此，提取工艺直接关系到中药材的利用率和后续加工的难易，是中药生产现代化的重要环节[2]。因此，优化石榴多酚的提取工艺十分必要。

目前石榴多酚的提取多采用煎煮法。该法具有操作简便、成本低等特点，但易破坏活性成分、杂质含量高、分离纯化困难。超声提取是利用超声波辐射产生的强烈的空化效应、机械振动、扰动效应、高的加速度、乳化、扩散、击碎和搅拌等多种作用，加快物质分子运动的频率和速度、增大溶剂的穿透力，从而加速目标成分进入溶剂。超声提取技术已应用于医药、食品等各个领域，特别是在中药材成分提取中应用广泛[3～5]。

作者采用超声技术从石榴皮中提取石榴多酚，考察了相关因素对提取率的影响，并比较了超声提取法和回流提取法的提取效率。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

石榴籽购自枣庄。

所用试剂均为分析纯。

KQ-500DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；RE-52型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；T-6新世纪紫外可见分光光度计，普析通用仪器有限责任公司；循环水多用真空泵，河南巩义英峪予华仪器厂；DZF-6051型真空干燥箱，上海一恒科技有限公司；高速万能粉碎机，天津泰斯特仪器有限公司。

1.2 超声提取石榴皮多酚

称取粒径20目的石榴皮粉末5 g，置于250 mL锥形瓶中，加入40%乙醇50 mL，置于超声仪内30 ℃超声振荡30 min，取出，以2000 r·min-1离心沉降10 min，沉降液即为多酚提取液。

1.3 回流提取石榴皮多酚

称取粒径40目的石榴皮粉末5 g，按1∶15(g∶mL)的料液比加入40%乙醇，加热至微沸回流提取。分别在30 min、40 min、50 min、60 min、70 min、90 min、110 min时，取少量提取液以2000 r·min-1离心沉降10 min，沉降液即为多酚提取液。

1.4 石榴皮多酚含量的测定[6]

1.4.1 对照品溶液的制备

精密称取没食子酸对照品50 mg，置100 mL棕色量瓶中，加水溶解并稀释至刻度；精密量取5 mL，置50 mL棕色瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液(没食子酸浓度0.05 mg·mL-1)。

1.4.2 标准曲线的绘制

精密量取对照品溶液0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL，分别置25 mL棕色量瓶中，各加入磷钼酸试液1.0 mL，再分别加水至12.0 mL，加29% Na2CO3溶液稀释至刻度，摇匀，放置30 min，以相应的试剂为空白，测定760 nm波长处吸光度。以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线。拟合得到回归曲线y=3.7758x-0.0018(R=0.9997)，表明没食子酸在0.01～0.001 mg·mL-1范围内线性关系良好。

1.4.3 样品溶液的制备

精密量取一定体积挥去溶剂的石榴皮提取液，加水稀释至一定倍数，摇匀，即得样品溶液。

1.4.4 多酚含量的测定

总酚含量：精密量取样品溶液2 mL，置25 mL棕色量瓶中，按1.4.2方法自“加入磷钼酸试液1.0 mL”起，加水10 mL，测定吸光度，根据标准曲线读出样品中没食子酸的量(mg)，计算，即得。

不被吸收的多酚含量：精密量取样品溶液25 mL，加至已盛有0.6 g干酪素的100 mL具塞锥形瓶中，密塞，置(30±2) ℃水浴中保温1 h，时时振摇，取出放冷，滤过，弃初滤液，精密吸取续滤液2 mL置25 mL棕色量瓶中，按1.4.2方法自“加入磷钼酸试液1.0 mL”起，加水10 mL，测定吸光度，根据标准曲线读出样品中没食子酸的量(mg)，计算，即得。

按下式计算石榴皮多酚含量：

石榴皮多酚含量=总酚含量-不被吸收的多酚含量

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 乙醇体积分数的影响

石榴皮多酚结构中含有多个羟基，极性较大，根据相似相溶原理，在含水醇中溶解度较大。分别以纯水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇、100%乙醇为溶剂，按1.2方法提取石榴皮多酚，考察乙醇体积分数对提取率的影响，结果见图1。

图1 乙醇体积分数对提取率的影响

由图1可知，乙醇体积分数为40%时提取率最高；当乙醇体积分数超过40%后，由于溶剂的极性有所降低，石榴皮多酚的溶解度逐渐下降。因此，选用40%乙醇作为提取溶剂。

2.1.2 石榴皮粒径的影响

在石榴皮粒径分别为10目、20目、40目、60目的条件下，按1.2方法提取石榴皮多酚，考察石榴皮粒径对提取率的影响，结果见图2。

图2 石榴皮粒径对提取率的影响

由图2可知，石榴皮粒径对超声提取率的影响很明显。随着粒径的减小，提取率明显提高。这是因为，粒径减小意味着药材完整的细胞结构被破坏，细胞内的有效成分更容易提取出来。因此，为了更快更完全地浸出有效成分，在石榴皮预处理(粉碎)时，必须尽量破坏其细胞结构，使石榴皮粒径尽可能地小，同时石榴皮应该具有必要的机械结构性能，以保证溶剂在粒子和粒子之间渗透良好。

2.1.3 提取时间的影响

在石榴皮粒径为60目，提取时间分别为20 min、30 min、40 min、50 min、60 min的条件下，按1.2方法提取石榴皮多酚，考察提取时间对提取率的影响，结果见图3。

图3 提取时间对提取率的影响

由图3可知，提取时间对石榴皮多酚提取率影响明显。随着提取时间的延长，提取率不断上升；但提取时间超过50 min后，提取率反而下降。这是因为，超声波对细胞壁有破坏作用，随着提取时间的延长，破坏程度加大，溶出物增多，提取率相应升高；但提取时间超过50 min后，由于多酚类物质的结构可能被超声波所破坏，导致提取率有所下降。

2.1.4 提取温度的影响

在石榴皮粒径为60目，提取温度分别为20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃的条件下，按1.2方法提取石榴皮多酚，考察提取温度对提取率的影响，结果见图4。

图4 提取温度对提取率的影响

由图4可知，在较低温度下，随着提取温度的升高，提取率不断上升；但提取温度超过40 ℃后，随着提取温度的升高，提取率反而下降。

药材提取率的高低主要与溶剂的溶解能力有关，而溶剂的溶解能力又与温度相关联。提取温度升高，就会增加溶剂分子和有效成分分子的动能，加速分子运动，促进有效成分溶解。在超声波下，温度对提取率的影响遵循同样的规律，但提取率的提高不完全归因于溶剂溶解能力的影响。超声作用引起的空化效应、机械效应等也有一定的贡献。一般来说，温度升高，溶剂的表面张力系数及粘滞系数下降，蒸汽压增大，超声空化域值下降，有利于空化泡的产生；另一方面，蒸汽压增大(由于温度的升高)，又会导致空化强度或空化效应下降，从而不利于提取过程的强化。从超声空化引起提取率升高的角度说，应在较低温度条件下工作，利用在较低的温度下强烈的空化效应进行超声提取达到单纯升高温度时同样的效果。因此，在石榴皮多酚提取过程中，适当升高温度有利于提高提取率。但温度过高会造成溶剂气化，浸出过程难以进行，也不利于提高提取物的质量。

2.1.5 料液比的影响

在石榴皮粒径为60目，料液比(g∶mL，下同)分别为1∶7.5、1∶10、1∶15、1∶20的条件下，按1.2方法提取石榴皮多酚，考察料液比对提取率的影响，结果见图5。

图5 料液比对提取率的影响

由图5可知，随着溶剂用量的增大，石榴皮多酚的提取率明显升高。这是由于溶剂用量大，溶剂中石榴皮多酚的相对浓度低，物料及溶剂边界层的石榴皮多酚浓度差大，扩散推动力大，因而提取率升高，但溶剂用量超过一定程度后，提取率升幅趋缓。因而溶剂量太大在经济上不合算。

2.2 正交实验

单因素实验结果表明，乙醇体积分数对石榴皮多酚提取率影响较小，因而确定提取溶剂为40%乙醇。在此基础上，以料液比、石榴皮粒径、提取时间、提取温度为主要影响因素，通过正交实验确定其最佳提取工艺。正交实验结果与分析见表1。

表1 正交实验结果与分析

由表1可以看出，对提取率影响最显著的因素是石榴皮粒径，为保证较佳的提取率，实验中必须严格控制石榴皮粒径；而提取温度的影响最小，可以根据具体情况进行适当的调整。确定石榴皮多酚的最佳超声提取条件为：以40%乙醇为溶剂，石榴皮粒径40目，提取温度30 ℃，提取时间50 min，料液比1∶15。在此条件下提取3次，提取率分别为15.86%、17.13%、16.32%，平均提取率为16.44%，高于正交实验中最高提取率，证明本实验确定的提取条件是合理的。

2.3 超声提取法与回流提取法比较(图6)

图6 超声提取法与回流提取法比较

由图6可知，超声提取法和回流提取法的提取率都随着提取时间的延长而上升，回流提取110 min与超声提取50 min的提取率接近。对于超声提取法，提取时间过长反而会使提取率下降；而回流提取法在提取率增加到一定程度后，再延长提取时间，提取率升幅不明显。超声提取法的提取率明显高于回流提取法，即使加热回流提取在70 min后达到稳定状态，其提取率也比超声提取的最大提取率低。这表明超声提取法无论是提取时间还是提取率均优于回流提取法。