pH值对克雷伯氏肺炎杆菌发酵甘油产1，3-丙二醇的影响与控制

徐卫涛，钟志辉，付水林，宫 衡

(华东理工大学 生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237)

1，3-丙二醇(1，3-Propanediol，1，3-PD)是最有发展前途的大宗化工原料之一，广泛应用于化妆品、食品和医药等工业领域[1]。其主要生产方法有环氧乙烷合成法、丙烯醛合成法和微生物发酵法，其中微生物发酵法研究最多的生产菌株之一为克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiellapneumoniae)，其以甘油为底物经一步发酵生产1，3-PD，在发酵过程中产生大量的副产物，主要包括乳酸、2，3-丁二醇(2，3-BD)等[2]。为了有效地提高1，3-PD的产率，就必须降低各种副产物尤其是乳酸的生成[3]。1，3-PD是一种生长关联型物质[4，5]，发酵pH值会影响菌体的生长，进而对1，3-PD的合成产生重要影响。

作者在此研究了克雷伯氏肺炎杆菌发酵甘油过程中不同的pH值控制对1，3-PD和副产物生成的影响。通过两阶段的pH值控制策略，调控代谢途径走向，以降低乳酸的生成、提高1，3-PD浓度和甘油转化率[6]。

1 实验

1.1 菌株与培养基

克雷伯氏肺炎杆菌KG1，自行筛选。

种子培养基(g·L-1)：K2HPO4·3H2O 7.0，(NH4)2SO41.0，KH2PO42.0，MgCl2·6H2O 0.1，酵母膏7.0，微量元素0.3 mL，pH值7.0。

发酵培养基(g·L-1)：KCl 0.75，NaH2PO4·2H2O 1.38，(NH4)2SO45.35，Na2SO40.28，MgSO4·7H2O 0.26，柠檬酸0.42，酵母膏2.0，微量元素0.3 mL，pH值7.0。

微量元素配比(g·L-1)：ZnCl234.2，FeCl3·6H2O 2.7，MnCl2·4H2O 10.0，CuCl2·2H2O 0.85，CoCl2·2H2O 23.8，H3BO30.31，Na2MoO4·2H2O 0.25。

1.2 培养方法

培养条件：装液量50 mL/250 mL，培养温度37 ℃，转速200 r·min-1，培养时间12 h。

发酵采用5 L全自动发酵罐(上海国强生化装备有限公司)，初始发酵培养基体积2 L，接种量5%，初始甘油浓度40 g·L-1，发酵液pH值7.0，发酵温度37 ℃，采用2 mol·L-1的KOH溶液控制发酵过程中pH值，过程流加甘油，发酵时间30 h。

1.3 分析方法

生物量通过测定620 nm下的吸光度值来获得。

甘油浓度采用高碘酸钠氧化法测定[7]。

副产物中的醇类物质采用GC112A型气相色谱测定。色谱柱采用AT SE-54型毛细管柱(30 m×0.53 mm×1.0 μm)，色谱工作站采用杭州普惠科学仪器有限公司的Sepu3000，载气为高纯氮气，FID氢火焰检测器，柱温120 ℃，进样器和检测器温度为250 ℃。

副产物中的有机酸采用高效液相色谱法测定。色谱柱为Dikma Platisil-C18，流动相为0.01 mol·L-1磷酸铵-5 mmol·L-1四甲基氢氧化铵，流速1.0 mL·min-1，柱温30 ℃。

2 结果与讨论

2.1 甘油发酵过程分析(图1)

图1 甘油发酵过程中生物量、1，3-PD浓度和甘油比消耗速率的变化趋势

由图1可知，在发酵14 h前，生物量持续增长、甘油比消耗速率不断加快，1，3-PD浓度也伴随着生物量增长迅速升高；发酵14 h后，菌体进入稳定期，生物量增长停止，随着发酵补料和补碱液的进行，菌体生物量有所下降，此时甘油比消耗速率迅速下降，菌体活力降低，1，3-PD浓度升幅趋缓。发酵的前14 h，1，3-PD浓度增加了40 g·L-1以上；发酵的后16 h，1，3-PD浓度仅增加20 g·L-1。这表明，1，3-PD浓度的升高与菌体生长和菌体活力有关。

2.2 不同的pH值控制对甘油发酵的影响

克雷伯氏肺炎杆菌最适生长pH值为6.3～7.3，控制发酵过程pH值为6.3和7.0，分别研究两个pH值下甘油发酵过程中生物量及副产物(2，3-BD、乳酸)的变化趋势，结果见图2。

图2 控制不同pH值条件下甘油发酵的生物量及副产物的变化趋势

由图2可知：(1)发酵的前14 h，即菌体高速生长时，高pH值下菌体生长更快一点，说明高pH值更有利于菌体生长；发酵的后16 h，两个pH值条件下的生物量均呈下降趋势，但高pH值下的生物量降低较快。(2)副产物2，3-BD在发酵前期生成速度最快，恰好与菌体生长速度最快的时期对应，低pH值下2，3-BD的生成速度和最终浓度均高于高pH值条件，最终浓度高出约70%。(3)高pH值下的乳酸浓度比低pH值高出约37%，且发酵后期高pH值下的乳酸生成速度明显快于低pH值。这表明乳酸的产生主要是在发酵后期，是在菌体生长的降速期和衰亡期大量产生的。这可能是因为，不同的pH值对代谢途径中关键酶的酶活有影响[8，9]。由于1，3-PD的合成过程中需要还原力NADH2，而在甘油生成副产物2，3-BD和乳酸过程中，消耗1分子甘油分别产生1.5和1分子NADH2，副产物是2，3-BD时还原力的生产效率更高一点，因此生成2，3-BD比生成乳酸更有利于1，3-PD的合成[10]。2，3-BD的高速生成期处于发酵过程的菌体的对数生长期，而乳酸的高速生成期为发酵过程后期，比较两种发酵条件下的发酵结果，见表1。

表1 不同pH值控制下甘油发酵产1，3-PD的结果

由表1可知，低pH值条件下1，3-PD的终浓度高于高pH值条件，但是甘油的摩尔转化率相差不大。这是由于，低pH值下甘油消耗更多，虽然副产物2，3-BD的浓度大，但能够提供较大量的还原力，但会影响甘油的摩尔转化率。

2.3 两阶段pH值控制策略对发酵过程的影响

通过两阶段控制pH值来抑制发酵过程中乳酸的生成，即在发酵的前14 h控制pH值为7.0、后16 h控制pH值为6.3，结果见图3。

图3 两阶段pH值控制策略对甘油发酵过程的影响

由图3可知，两阶段pH值控制策略能够有效地抑制乳酸的大量生成，乳酸的最终浓度只有11.17 g·L-1，比恒定pH值条件下的浓度要低；1，3-PD浓度在发酵后期增长速度没有明显提高，但最终浓度达到67.32 g·L-1，甘油的摩尔转化率达到61%。

3 结论

研究了克雷伯氏肺炎杆菌发酵甘油过程中不同的pH值控制对菌体生长、产物和副产物生成的影响。结果表明，pH值较低时菌体生长较慢，有利于2，3-丁二醇的生成，pH值较高时菌体生长较快，有利于乳酸的生成；通过两阶段pH值控制策略，即在发酵的前14 h控制pH值为7.0、后16 h控制pH值为6.3，能够有效地抑制乳酸的生成，1，3-PD的最终浓度达到67.32 g·L-1，甘油的摩尔转化率达到61%。

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