Red重组系统在克雷伯氏肺炎杆菌中的应用研究

莫隽颖，陶 冶，周佳佳，高黎荣，付水林，宫 衡

(华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237)

目前，克雷伯氏肺炎杆菌基因敲除的相关研究多为利用oriR6K型自杀质粒的传统敲除方法[1～4]，其实验周期较长，且整合到受体菌株基因组上的抗性标记无法去除，不适用于多基因突变的研究。

Datsenko等[5]构建了一套适用于E.coliK-12菌株靶基因快速敲除的Red重组质粒系统。该系统需要3类质粒，分别是：表达Exo、Beta、Gam蛋白的协助同源重组质粒pKD46、pKD20等；两侧含FRT位点的抗性基因的质粒pKD3、pKD4、pKD13；受诱导表达FLP重组酶以消除基因组上同源重组抗性基因的质粒pCP20。利用Red重组质粒系统敲除靶基因的主要流程是：(1)以pKD3/pKD4为模板，设计含40～60 bp靶基因的同源序列引物，PCR扩增含FRT位点的抗性基因(打靶片段)；(2)将打靶片段转化到已表达Red重组酶的宿主中，抗性筛选阳性克隆；(3)将pCP20导入筛选出的重组子中，诱导FLP重组酶表达，移除抗性标记。Red重组质粒系统已被证实也能在其它一些菌株中有效地敲除靶基因[6，7]，但目前尚没有Red重组系统在克雷伯氏肺炎杆菌中应用的报道。作者在此以荚膜基因wzi作为敲除对象[8，9]，研究了Red重组系统在克雷伯氏肺炎杆菌中的敲除效果。

1 实验

1.1 菌株与质粒

K.pneumoniae，自行筛选。

E.coliDH5α、 pKD46、 pKD4、 pCP20，自行保存；载体pMD18T、质粒pBR322，TaKaRa公司。

1.2 限制性内切酶与主要试剂

XmnⅠ限制性内切酶，Fermentas公司；T4连接酶、DL 10 000TMDNA Marker，TaKaRa公司；2×TaqPCR MasterMix、2×TaqPlus PCR MasterMix、DNA MarkerⅢ、细菌基因组DNA抽提试剂盒、质粒小量提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒，北京天根公司；其它试剂均为国产分析纯。

1.3 细菌培养、电转化及PCR方法

参见《分子克隆》。

1.4 引物设计

实验所用引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成，见表1。

表1 实验中所用的引物

1.5 适用于克雷伯氏肺炎杆菌的Red重组系统的构建

由于K.pneumoniae菌株本身含有Amp抗性，故pKD46与pCP20质粒不能直接用于该菌株的基因敲除实验，需要对其改造。通过序列查找发现这两个质粒的Amp抗性基因上有一个XmnⅠ限制性酶切位点，且整个质粒中该位点只有一个[10]，在该位置插入其它抗性基因可以使这两个质粒具有新的抗性标记，同时去除了Amp抗性标记。构建方案见图1。

图1 pKD46-Tc和 pCP20-Tc的构建

首先扩增适合的抗性基因。以pBR322质粒为模板，设计其四环素抗性基因的引物F-tet和R-tet，两端加上XmnⅠ酶切位点，PCR扩增tet基因，胶回收tet片段，连到pMD18 T载体后转化至DH5α感受态细胞中，涂LB平板(含盐酸四环素20 μg·mL-1)，37 ℃过夜培养12～16 h；次日挑取单克隆扩增后抽质粒，用XmnⅠ酶切鉴定重组质粒tet-pMD18T。

用T4连接酶将片段tet分别与同样经XmnⅠ酶切的pKD46和pCP20 连接，将连接产物转化至DH5α感受态细胞中，涂LB平板(含盐酸四环素20 μg·mL-1)，30 ℃过夜培养16～20 h，挑取单克隆扩增后抽质粒，用XmnⅠ酶切鉴定重组质粒pKD46-Tc和pCP20-Tc。

将pKD46-Tc转化到K.pneumoniae菌株中，涂LB平板(含盐酸四环素20 μg·mL-1)，30 ℃培养过夜，得到的K.pneumoniae/pKD46-Tc菌株阳性克隆，根据pKD46质粒上exo-bet-gam基因设计引物F-46和R-46，进行菌落PCR鉴定。

1.6 二步PCR法扩增片段△wzi：：FK

由于直接合成同源臂的成本较高且长度有限，故采用二步PCR的方法来扩增得到重组片段[6]。以pKD4质粒为模板，设计引物F-FRT和R-FRT，扩增两端含FRT位点的kan抗性基因片段FK(约1500 bp)。确定同源臂为250 bp，设计wzi片段的上游250 bp序列的两端引物Fup-wzi和Rup-wzi：：FRT，反向引物的5′端加入F-FRT的序列，wzi片段下游250 bp序列的两端引物Fdown-FRT：：wzi和Rdown-wzi，正向引物的5′端加入R-FRT的序列，以wzi-pMD18T为模板扩增。将PCR扩增得到的3个片段up-wzi、down-wzi、FK按物质的量比1∶1∶1混合作为模板，以Fup-wzi和Rdown-wzi为引物，扩增片段△wzi：：FK(1981 bp)。

1.7 wzi基因缺失阳性重组子的获得

制备K.pneumoniae/pKD46-Tc电转化感受态细胞，加20 mmol·L-1L-阿拉伯糖，30 ℃诱导Red重组酶表达2.5 h。电转化体系为5 μL △wzi：：FK片段+100 μLK.pneumoniae/pKD46-Tc感受态细胞，电转化条件2500 V、5～6 ms，转化后涂LB板(含卡那霉素20 μg·mL-1)，37 ℃过夜培养。以wzi上下游外侧的序列设计重组子鉴定引物Fupout-wzi和Rdownout-wzi，菌落PCR鉴定基因敲除的效果。

2 结果与讨论

2.1 重组质粒tet-pMD18T的构建

tet基因的PCR产物及tet-pMD18T的XmnⅠ酶切片段见图2。

1.tet基因的PCR产物 2、3.tet-pMD18T的XmnⅠ酶切片段M.DNA MarkerⅢ

由图2可看出，重组质粒tet-pMD18T的酶切片段有3个。这是因为，pMD18T质粒本身含有一个XmnⅠ酶切位点，中间那条1300 bp左右的片段为tet片段。

2.2 重组质粒pKD46-Tc与pCP20-Tc的构建

重组质粒pKD46-Tc和pCP20-Tc的酶切鉴定结果见图3。

1.pKD46-Tc digested by XmnⅠ 2.pCP20-Tc digested by XmnⅠ 3.pKD46-Tc plasmid 4.pCP20-Tc plasmid M1.DL 10 000TM DNA Marker M2.DNA MarkerⅢ

在图3中2000～1000 bp的位置能看到一条目的片段。由于重组质粒pKD46-Tc和pCP20-Tc是低拷贝质粒，量较少，所以酶切的片段不是太明显。由于克隆的是Tc抗性基因，菌体能在Tc抗性的培养基中生长，表明该基因已成功表达，故不测序。

2.3 K.pneumoniae/pKD46-Tc菌株的筛选(图4)

1～11.the 11 monoclones 12.pKD46-Tc plasmid(positive) 13.K.pneumoniae(negative) M.DNA MarkerⅢ

由图4可以看出，1#～10#阳性克隆均有相似大小的条带，11#克隆没有条带，12#阳性对照有明显的目的片段(1922 bp)，13#阴性对照无条带。表明1#～10#均转入了pKD46-Tc，得到了K.pneumoniae/pKD46-Tc菌株。

2.4 二步PCR法扩增片段△wzi：：FK(图5)

1.up-wzi 2.down-wzi 3～12.退火温度(℃)：45、46.2、47.4、50.2、53.1、40、44、48.8、51.2、53.6 M.DNA MarkerⅢ

由图5a可以看出，up-wzi和down-wzi片段的大小在250 bp左右处，与理论位置相符。由图5b可以看出，在1500 bp左右有明显的条带，应为FK片段，且随退火温度的升高条带亮度逐渐增强。估算up-wzi浓度约为60 ng·μL-1、down-wzi浓度约为20 ng·μL-1、FK浓度约为10 ng·μL-1。由图5c可以看出，除了目的条带△wzi：：FK(1981 bp)外还有一些非特异条带。胶回收图中2000 bp左右的条带，考虑到以此条带为模板PCR扩增的效果不好，存在较多非特异性条带，扩增前需要将该片段与T载体相连进行亚克隆。

2.5 wzi基因缺失重组子的鉴定

卡那霉素抗性平板上长出9个克隆，用引物Fupout-wzi和Rdownout-wzi PCR鉴定，结果见图6。

1～9.阳性克隆 10.K.pneumoniae genome DNA(未敲除的基因对照) 11.ddH2O(阴性对照) M.DNA MarkerⅢ

未敲除的原始序列PCR产物应该在1500 bp左右的位置，理论上重组子PCR产物应该在2000 bp左右的位置。由图6可以初步确定9个克隆中有6个是wzi基因敲除的重组子，其余3个克隆为假阳性。

3 结论

通过构建含四环素抗性标记的重组质粒pKD46-Tc和pCP20-Tc，建立了一套能在K.pneumoniae菌株中运用的Red重组系统，以荚膜基因中的高保守wzi基因为敲除对象，导入同源臂为250 bp的打靶片段Δwzi：：FK，转化后得到6个重组子，通过菌落PCR鉴定初步确定敲除了K.pneumoniae菌株的wzi基因。在后续的研究中，需要利用pCP20-Tc质粒表达FLP重组酶将抗性筛选标记去除，得到不含抗性基因的基因敲除重组子，并且对wzi基因缺失株的荚膜表达进行鉴定，分析wzi基因缺失对荚膜多糖合成的影响。Red重组系统的建立为后续K.pneumoniae菌株代谢途径有关基因突变株的构建奠定了一定基础。

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