胡黄连SRAP反应体系的建立与引物筛选*

任李玥，刘小莉

(1.云南中医学院中药学院，云南昆明 650500;2.云南省食品药品检验所，云南昆明 650011)

胡黄连Neopicrorhiza scrophulariiflora(Pennell)Hong为玄参科Scrophulariaceae胡黄连属Neopicrorhiza的多年生草本植物，分布区狭窄，特产东喜马拉雅和横断山区［1］。根状茎为重要的中、藏药材，具有清湿热，除骨蒸、消疳热的功效［2］。由于过度采挖，资源濒临枯竭，作为国家二级保护植物，列入《中国珍稀濒危保护植物名录》中［3］。对其继续科学保护和合理利用已刻不容缓。

相关序列扩增多态性 (SRAP，Sequence—related Amplified Polymorphism) 是由 Li 和 Quiros［4］于2001年发展起来的一种分子标记。其原理是针对基因外显子中GC含量丰富，而启动子、内含子中AT含量丰富的特点来设计两组引物进行PCR扩增，因不同个体的内含子、启动子与外显子间隔区长度不等而产生多态性。该标记具有简便、高效、产率高、高共显性、重复性好、易测序、便于克隆目标片段的特点，已成功地应用于多个物种遗传多样性分析［5－6］、遗传图谱的构建［7］等方面。对不同植物类群而言，SRAP的最佳反应条件会有所差别，本实验拟摸索适合胡黄连SRAP扩增反应的条件，为后续基于SRAP探讨胡黄连的遗传多样性奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验所用样品采自西藏定日县 (N86°26'，E28°08'，4248m)胡黄连幼嫩叶片，硅胶干燥后保存于－20℃。

1.2 试剂

琼脂糖购自GENE TECH(SHANGHAI)COMPANY LIMITED;Tris－HCl、EDTA购自美国 AMResco公司;二甲基亚砜购自云科生物工程公司;SRAP引物由上海生物工程有限公司合成;dNTPs、RNA酶、Taq酶购自大连宝生物工程有限公司。

1.3 仪器

Eppendorf AG离心机，Biometra PCR仪，BIO－RAD凝胶成像系统，BIO－RAD电泳仪，Bio-Photometer plus核酸蛋白测定仪，XW－80A型漩涡混合器等。

1.4 实验方法

1.4.1 基因组DNA提取与检测

采用改良的CTAB法提取基因组DNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，根据样品OD260/OD280计算DNA纯度;根据OD260值计算样品DNA浓度，稀释至10 ng·μL－1，保存于－20℃冰箱中。

1.4.2 正交反应体系建立

由于本课题组前期研究发现，模板DNA在很大的一个浓度范围内对PCR反应体系均无影响，因此本文未对DNA模板浓度进行优化，而是在20μL反应体系中直接选用20ngDNA作为模板。参考狗牙根［5］、丹参［8］的 SRAP 反应条件，初设dNTP、Taq酶、Mg2+、引物浓度、模板浓度各4个水平，dNTP分别为150，200，250，300μmol·L－1;Taq酶分别为 0.5，1.0，1.5，2.0U;Mg2+分别为1.5，2.0，2.5，3.0mmol·L－1;引物浓度分别为0.2，0.3，0.4，0.5μmol·L－1;模板浓度5，10，15，20ng形成5因素4水平的试验方案。反应选用引物Me4Em3，反应体系为20μL，内含10×PCR buffer 2μL，DNA 浓度20ng，其余成分按照表1进行，建立16个反应组合。反应程序为:94℃预变性5min，反应前5个循环94℃变性1min，35℃退火1min，72℃延伸1min。之后35个循环复性温度提高到50℃，最后延伸1min，72℃延伸5min，4℃保存。PCR产物在含溴化乙锭的1.8%琼脂糖凝胶中，以0.5×TBE为电泳缓冲液电泳分离，最后用紫外成像系统 (Tanon GIS一2009)观察并成像 (见表1)。

表1 胡黄连SRAP L16(4)正交试验组合

1.4.3 引物筛选

引物采用Li和 Quiros［4］已发表的引物进行两两配对，共产生30对引物组合，以随机选取的胡黄连DNA作为模板，采用正交试验中初选出来的反应体系进行PCR扩增。

1.4.4 退火温度筛选

本实验设置了 30.0，30.2，30.9，32.0，33.2，34.4， 35.6， 36.8， 38.0， 39.1， 39.8，40.0℃共12个退火梯度，共进行两组PCR扩增，第一组每个PCR反应体系中加入1μL 5%的DMSO，第二组不加，作为对照。

2 结果与分析

2.1 反应条件的建立

16个正交实验结果从图1可以看出，6号以及9～16号无扩增产物，其余均有扩增产物。其中1，2，7，8号扩增的条带弱，3～5号条带较清楚，但3号和5号扩增条带数少，均予以淘汰。只有4号所扩增的条带清晰且条带数多。因此，确定16个组合中第4号组合的体系为最理想的SRAP－PCR反应体系。

图1 胡黄连正交试验扩增图

2.2 引物筛选

30条引物组合中有27条引物组合能够扩增出片段，这27条引物组合中，有13对引物组合的扩增片段多、清晰、重复性较好 (见表2)，这13对引物组合可以作为胡黄连后续研究的引物。

表2 30对SRAP引物的筛选结果

2.3 退火温度和图谱背景优化

从图2可见，在30.0～40.0℃的退火温度下，均有扩增，且退火温度越高，扩增出的条带越少，退火温度在30.0～33.2℃范围内均扩增出比较理想的带型。在PCR反应体系中添加5%DMSO和不加DMSO的两组相比较，前者的图谱背景比不加的要清晰。

图2 不同退火温度对扩增结果的影响

3 讨论

影响SRAP－PCR反应的因素相对复杂，不同植物适合的SRAP反应体系不同，且各因素之间存在互作效应，4个因子之间的浓度配比只有达到最佳状态时，才能得到稳定的、可重复的扩增结果［9］，本实验采用了一次正交实验，即建立了适合胡黄连的SRAP反应体系:20μL反应体系 (含10 × buffer)，dNTP150 μmol·L－1，Mg2+3.0 mmol·L－1，Taq 酶 2U，引物 0.5μmol· L－1，DNA 20ng。

Li和Quiros［4］的程序中，为了让上、下游引物与DNA模板能部分配对，最初5个循环的退火温度较低，设置为35℃，为了提高引物扩增的特异性，后35个循环反应的退火温度升50℃。由于SRAP引物具有通用性，不同种植物所用的引物组合往往相同，因此扩增程序差异不大。本研究对PCR结果影响较大的退火温度进行了梯度比较试验，筛选出了30.0～33.2℃的最佳退火温度。

本研究对比了在琼脂糖中添加终浓度5%的DMSO与对照组 (不加DMSO)对电泳图谱背景清晰度的影响，结果显示加入终浓度5%的DMSO的电泳图谱的背景明显清晰。据此确定SRAP反应最终反应体系为 20μL反应体系 (含 10×buffer 2μL)，dNTP150μmol·L－1，Mg2+3.0mmol·L－1，Taq 酶 2U，引物 0.5μmol·L－1，DNA 20ng，1μ LDMSO，无菌水补齐，凝胶电泳时在琼脂糖中添加5%的DMSO。

本实验建立了适用于胡黄连稳定的、重复性强、中等产率的SRAP－PCR反应体系，并对30条引物组合进行了初步筛选，从30对引物组合中筛选到了13对扩增片段多、清晰、重复性较好引物组合，结果为SRAP技术应用到胡黄连的遗传多样性分析中奠定了基础。

［1］吴征镒，周浙昆，李德铢，等.世界种子植物科的分布区类型系统 ［J］.云南植物研究，2003，25(3):245－257

［2］国家药典委员会.中华人民共和国药典 (一部)［M］.北京:化学工业出版社，2005:167.

［3］国家环境保护局.中国珍稀濒危保护植物名录 (第1册)［M］.北京:科学出版社，1987.

［4］LI G，QUIROS C F.Sequence－related amplified polymorphism(SRAP)，a new marker system based on a simple PCR reaction:its application to mapping and gene tagging in Brassica ［J］.Theor Appl Genet，2001，103:455–461.

［5］杨益洁，张新全，黄琳凯，等.野生狗牙根种质遗传多样性的SRAP研究 ［J］.遗传，2008，30(1):94－100.

［6］王常林，郭巧生，武玉妹.明党参遗传多样性的SRAP分子标记 ［J］.中国中药杂志.2009，24(34):3180－3183.

［7］高丽霞，刘念，黄帮海.姜黄属SRAP分子标记连锁图谱构建 ［J］.云南植物研究，2009，31(4):317－325.

［8］李廷春，高正良，汤志顺.丹参SRAP反应体系的建立与优化 ［J］.生物学杂志，2008，25(1):40－44.

［9］陈大霞，李隆云，瞿显友，等.正交设计优选味连简单序列重复间扩增多态性反应体系的研究 ［J］.时珍国医国药，2008，19(1):11－12.