培养基不同血清比例对人胃癌SGC－7901细胞生长的影响

陈舒怡，姜学伟，赵 刚

（湖北中医药大学 基础医学院，湖北 武汉 430065）

SGC－7901细胞是20世纪80年代初由我国上海市第六人民医院肿瘤研究组、复旦大学遗传研究所、中国科学院上海药物研究所和上海市肿瘤研究所等单位进行协作研究而培养建立的一株胃腺癌细胞株，肿瘤材料来自于一位56岁的女性胃腺癌患者。在培养过程中，SGC－7901细胞一直保持恶性上皮样细胞的形态特点，如核质比较大，多数细胞为单核，核仁清晰［1］。

SGC－7901细胞株自建立以来在肿瘤学、药理学和细胞生物学等研究领域获得了广泛应用，对于抗胃癌药物的药效评价与作用机理的揭示以及中草药植物的抗癌有效成分筛选等方面的研究发挥了重要作用。

众所周知，血清是细胞体外培养时在培养液中不可缺少的营养成分，能为细胞的生长提供必须的生长因子。目前国内的实验室在培养SGC－7901细胞时，一般在培养液中加入10%左右比例的新生牛血清或小牛血清［2］。而目前市售国产新生牛血清的价格是每100mL百元人民币以上，随着养牛成本的逐年提高，牛血清的价格还会逐步提高。因此在细胞培养实验中，血清是花费最多的常用试剂。在这种背景下，积极探索低血清细胞培养条件很有意义。我们根据肿瘤细胞能够自行合成分泌生长因子，对外源血清依赖性较低的理论［3］，尝试在培养SGC－7901细胞时，减少培养液中血清的比例。我们利用倒置显微镜和酶标仪观察并检测了该细胞在3%、6%和9%等血清比例的培养基中的生长状态。

1 材料

1.1 肿瘤细胞株

人胃癌细胞株SGC－7901由武汉大学生命科学学院中国典型培养物保藏中心提供。

1.2 主要器材与仪器

低温冰箱（MDF－192型，日本SANYO公司），CO2培养箱（HF240型，Heal Force公司），低速离心机（800型，常州国华电器有限公司），超净台（YJ－875型，上海博讯实业有限公司），倒置显微镜（CK40型，日本OLYMPUS公司），高压灭菌器（常州国华电器有限公司），全自动酶标仪（Model 680型，BIO－RAD公司），微量移液器（10μL，200μL，1000μL，5mL上海大龙公司），T－25培养瓶（日本IWAKI公司），96孔培养板（日本IWAKI公司），塑料离心管 （15mL，美国Corning公司）。

1.3 主要试剂

RPMI 1640液体培养基（美国Hyclone公司），新生牛牛血清 （50mL装，购自杭州四季青生物工程材料有限公司），青霉素与链霉素（粉剂，华北制药公司），MTT（噻唑蓝，上海试剂一厂），二甲基亚砜（DMSO，Fisher公司），胰酶细胞消化液 （100mL装，碧云天公司）。

2 方法

2.1 配制不同血清浓度的培养基

在超净工作台中，分别配制含有3%、6%、9%血清和不含血清的RPMI－1640培养液（内含青霉素和链霉素各100U／mL），其中不含血清的培养基为空白对照。按分组在T－25型塑料培养瓶中分别加入相应血清含量的培养液，然后接种SGC－7901细胞。

2.2 细胞生长状态的MTT法检测

将人胃癌SGC7901细胞按2×103个细胞接种于96孔板内，每种浓度设3列共24个复孔，每孔体积200μL，37℃，5%CO2孵育，不同血清浓度的单列培养孔在12h、24h、48h后，先用倒置相差显微镜观察不同血清浓度条件下细胞的形态与生长状况，再向每孔加入 MTT溶液（5mg／mL）20μL，继续培养2.5h。终止培养，小心吸去孔内培养液，每孔加入150μL DMSO，振荡10min后，利用酶标仪，在选择490nm波长下，测定各孔的光吸收值（OD值），记录结果。

2.3 统计学方法

应用SPSS17.0统计分析软件进行数据统计处理，数据以（）表示，多组间比较采用双因素方差分析，两组间比较采用SNK法，P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 不同浓度血清培养后细胞的生长状态

倒置显微镜下可见，培养12h、24h、48h的细胞，3%、6%和9%等血清条件下，SGC－7901细胞的生长未见明显差异。贴壁细胞生长良好，胞浆饱满，形态舒展。而无血清对照组细胞生长状态较差，细胞呈圆形，体积小，有部分脱落。（见图2－图5）

3.2 MTT法检测细胞生长状态

SGC－7901细胞在含有3%、6%和9%新生牛血清的培养液中培养12h、24h和48h后，用MTT方法检测到的反映各组活细胞数量（即细胞生长状况）的OD值见表1。统计分析结果显示，不同时间组之间的检测结果差异无显著性（F＝0.005，P＝0.995），两组间比较结果，各组之间的差异无显著性（P＞0.05）。不同血清浓度组之间，两组比较结果：对照组与各血清浓度组之间差异均有显著性（P＜0.05），但3%、6%、9%血清浓度组之间差异无显著性（P＞0.05）（见表1），各组OD值与时间之间的关系见图1。

图1 四种不同血清条件的细胞在3个培养时间的生长状态（OD值）

表1 不同浓度血清培养液培养SGC－7901细胞不同时间的吸光度值（OD值）（）

表1 不同浓度血清培养液培养SGC－7901细胞不同时间的吸光度值（OD值）（）

注：与对照组相比，＊P＜0.05，血清各组间差异无统计学意义（P＞0.05）。

时间0.423±0.0300.329±0.0150.271±0.0443%血清 0.480±0.046＊ 0.508±0.027＊ 0.516±0.060＊6%血清 0.488±0.023＊ 0.525±0.041＊ 0.534±0.043＊9%血清 0.531±0.048＊ 0.572±0.058＊ 0.616±0.06112h 24h 48h对照组组别＊

4 讨论

新生牛血清或小牛血清是体外培养各类细胞时需要在RPMI－1640等人工培养基中添加的重要天然成分［3］，能为细胞提供包括多种生长因子在内的低分子营养物，对于细胞的生长发育具有重要作用。本实验结果也再次验证了血清的作用。利用倒置显微镜观察可见，在不含血清的对照组中，人胃癌SGC－7901细胞生长缓慢，形态呈圆形，体积小，出现部分脱落的现象。MTT法检测结果显示，对照组细胞的吸光度值（OD值）明显低于其余三个使用含血清培养基实验组的OD值。差异具有显著性。说明在对照组的无血清条件下，SGC－7901细胞的生长与增殖活性较为低下。

然而，血清的成分复杂，不仅存在促进细胞生长发育分裂增殖的生长因子，同时也存在有细胞生长的抑制因子或毒性因子，有些成分至今未完全搞清楚。细胞在含血清培养基中所呈现出来的生物学特性是复杂血清因子作用的结果［5］；同时，牛血清的价格越来越高，不断增加着细胞培养实验的成本。因此，近20多年来，国内外多个实验室在探索细胞的低血清培养甚至无血清培养技术和方法，取得了一些重要进展［6－7］。研究结果表明，有多种来自动物和人的正常细胞株以及肿瘤细胞株可以在低血清甚至无血清的培养基中正常地生长和增殖。当然，无血清培养基中一般需要另外加入多种生长因子、激素，才能维持细胞的正常生长［8］。

小牛血清含量为9%的PRMI－1640培养基是我们实验室培养人胃癌SGC－7901细胞最常使用的细胞培养液，也用于人宫颈癌HeLa细胞、人肝癌SMMC－7721细胞和人结肠癌HCT－116细胞等多种肿瘤细胞株的培养。之所以选择9%的血清比例是考虑到添加血清配制完全培养基时比较方便。现在国内的细胞培养实验室多使用500mL包装的无菌液体培养基，在超净工作台内按无菌操作将100mL包装的小牛血清直接倾倒1／2即50mL左右至装有500mL液体培养基包装瓶内，再加适量的双抗溶液，盖上瓶盖，充分混合后即成9%血清的细胞培养基。这样在培养基包装瓶内直接添加血清，操作简单快捷，不使用其它容器，减少了污染的机会。

本实验结果表明，人胃癌SGC－7901细胞在血清含量为6%和3%的RPMI－1640培养基中的生长状态与在9%血清含量培养基中的状态差异无统计学意义。表明3%血清含量培养基中的包括生长因子和激素在内的各种营养物质，可满足SGC－7901细胞的生长发育和分裂增殖的需要，在此条件下，癌细胞自身所合成和分泌的多种生长因子也发挥了一定的作用。根据本实验结果，在培养人胃癌SGC－7901细胞时，可应用血清含量在3%～6%的低血清培养基，以减少小牛血清的用量，从而降低细胞培养的实验成本，同时也可减少血清中有害成分的影响。

［1］刘玉琴，卞晓翠.实验细胞资源目录［M］.北京：人民军医出版社，2010：1－256.

［2］伍海鹰，陈一鸣，林龙，等.体外香菇多糖对顺铂抑制胃癌细胞增殖的促进作用［J］.世界华人消化杂志，2010，19（4）：244－248.

［3］GERALD KARP著.王喜忠等译.分子细胞生物学［M］.北京：高等教育出版社，2005：658－659.

［4］弗雷谢尼著.章静波等译.动物细胞培养－基本技术指南［M］.北京：科学出版社，2004：468－479.

［5］李文鑫.无血清细胞培养研究［M］.武汉：湖北科学技术出版社，1993：1－8.

［6］刘鹏，金岩等，刘源，等.不同种数真皮成纤维细胞在不同浓度血清培养基中生长的比较观察［J］.实用口腔医学杂志，2004，20（1）：16－19.

［7］梅建国，庄金秋，沈志强.动物细胞无血清培养技术研究进展［J］.生物技术，2010，20（3）：87－89.

［8］杨学义，刘飞，向双云，等.哺乳动物细胞无血清培养基研究进展［J］.动物医学进展，2011，32（2），69－72.