蒺藜不同产地化学成分HPLC－模糊聚类分析

2011-07-25张素军

亚太传统医药 2011年10期

张素军

（临沂大学生命科学学院，山东临沂 276000）

蒺藜（Tribulus terrestris L.）为蒺藜科（Zygophyllaceae）一年生草本植物，分布于全国各地，其果实具有平肝解郁、活血祛风、明目止痒等功效［1］。作为传统中药，蒺藜有着悠久的临床应用历史，并且全国通用。我国地域广袤，地理环境和气候条件相差很大，不同产地的蒺藜在发挥药效的物质基础上是否具有地域差异性以及道地性，这方面的研究将为蒺藜资源的合理利用和临床用药提供理论指导。本文应用中药指纹图谱技术中的高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）指纹图谱，对不同产地蒺藜的化学成分进行模糊聚类，以比较不同产地蒺藜在药效物质基础上的差异程度。

1 实验材料

蒺藜果实2009年8月中旬分别采自山东、河北、新疆、黑龙江、云南和福建，分别以SD、HB、XJ、HLJ、YN、FJ表示，经临沂大学生命科学学院副教授王文房鉴定，均为Tribulus terrestris L.的果实。取此果实，75%乙醇消毒3min、蒸馏水充分冲洗后，于55℃烘箱中烘干，机械粉碎后过45目筛，置干燥器内备用。所用试剂除特别说明外均为分析纯，水为双蒸水。

2 方法与结果

2.1 样品溶液的制备

分别精密称取蒺藜果实粉末5.0g，置具塞三角瓶中，加蒸馏水50mL，称重，室温放置30min后，100℃水浴中提取60min，称重，用蒸馏水补足减失重量，过滤，4000r·min－1离心10min，上清用0.4μm微孔滤膜滤过，即得。

2.2 色谱条件

KR 006C18色谱柱（250mm ×4.6mm ，5μm）；甲醇（A）－0.1%醋酸水溶液（B）为流动相，梯度洗脱如表1所示；柱温为 30℃；流速为0.5mL·min－1；检测波长为254nm；进样体积为10μL。所得色谱图以山东样品为例，见图1。6个样品的色谱峰以相对保留值进行排列。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验

按“2.1”项下制备山东样品溶液，连续进样5次，各共有色谱峰的相对峰面积的RSD均小于3%，表明本方法具有较高的精密度。

2.3.2 稳定性试验

按“2.1”项下制备山东样品溶液，分别于0h、4h、8h、12h和24h进样分析，各共有色谱峰的RSD均小于3%，表明样品至少在24h内是稳定的。

图1 山东蒺藜果实的HLC色谱

2.3.3 重现性试验

取山东样品5份，按“2.1”项下制备样品溶液，每份样品进样1次，各共有色谱峰的相对峰面积的RSD均小于3%，表明本方法重现性较好。

表1 HPLC流动相变化梯度

2.4 模糊聚类分析

2.4.1 原始数据的采集和处理

按“2.2”项获取六个产地蒺藜果实的HPLC色谱图，如图1所示（以山东果实为例），选取保留时间为22.3min左右的共有色谱峰为内参照峰，求出样品中所有峰的相对保留值α（α＝各组分峰的保留时间／内参照峰的保留时间）和相对峰面积RA＝某个峰的面积／内参照峰面积，在相对保留值1%的范围内进行共有峰排列，非共有峰的面积则以0记，如表2所示。以相对峰面积作为聚类指标。

2.4.2 模糊相似矩阵的建立

利用相关系数法对表5中的数据按公式

2.4.3 模糊等价矩阵的建立

根据平方法R→R2→R4→… 求模糊相似矩阵的传递闭包，即等价矩阵。由于R8＝R4，故R4为等价矩阵。

2.4.4 动态聚类

在0～1的范围内选取不同的置信水平λ值，求出等价矩阵的λ－截矩阵，从而在不同的λ水平上对对象进行模糊动态聚类，分类结果如下：

3 讨论

模糊性是事物所具有的类属和性态的不确定性，是反映事物本质的极为深刻的属性［2］。模糊聚类分析方法是对模糊性事物进行分类的方法，是对人脑模糊聚类的一种数学模写。不同产地的同种植物在化学成分的种类和含量上没有截然分明的界限，而是具有一定的模糊性，适于采用模糊聚类的方法进行分析［3，4］。同时，我们采用HPLC色谱法对蒺藜的水提物进行分析，得到的色谱峰的数目多，能够基本上反映其物质基础的整体面貌。在此基础上运用相关系数法对色谱峰进行模糊相聚类，结果发现，在0.999的置信水平上，六个产地的蒺藜聚为同一类，这是一个近乎为1.000的置信水平，这充分说明六个产地的蒺藜在化学成分上的种类和含量上可以说是没有差异的。尽管我们的样品数目较少，但由于地域跨度大，我们有理由相信，国内不同地区的蒺藜在药效的物质基础上基本上没有差异，这或许可以作为其可以通用而一直没有提出道地性的一个佐证。当然，我们的样品采集时间基本相同，不同采收期的蒺藜其化学成分是否有差异以及差异如何，需做进一步研究。