黄芪多糖对兔脂肪来源的间充质干细胞体外增殖的影响

何文涓，张兰芳，袁志坚，何晓升

(1.无锡卫生高等职业技术学校，江苏 无锡 214028;2.杭州师范大学 临床医学院，浙江 杭州 310036)

黄芪多糖(Astragalus Polysaccharides，APS)为中 药黄芪的提取物，有研究发现，一定浓度的APS在体外能促进人骨髓细胞中红细胞系和粒细胞系祖细胞的生成，这种促进作用在造血因子存在时，发挥的作用最大［1］。也有研究发现，短期低浓度APS能促进诱导培养的骨髓基质干细胞的代谢和蛋白质的合成，有利于细胞的增殖和向成骨分化［2］。

骨髓干细胞量不多，取材也不便。最近一些研究表明人体脂肪、胎盘等组织中的干细胞，具有惊人的可塑性，和胚胎干细胞一样，可以分化成各种各样的组织细胞。且脂肪来源的间充质干细胞(ASCs)贮藏量丰富，取材方便，因此对ASCs的研究具有极大的实用价值。本研究对兔ASCs进行培养，并观察APS对兔ASCs体外增殖的作用。

1 材料

APS注射液(批号:20090811)，成都新亨药业有限公司;四甲基偶氮唑盐(MTT)、碘化丙啶(PI)，美国 Sigma公司;抗体 CD14，美国 Caltag公司;CD29、CD44，美国 Chemcon 公司;CD45，美国 Antigenix公司;DMEM培养基、胎牛血清，美国Gibo公司。

3350型自动酶联免疫检测仪，美国Beckman公司;流式细胞仪，美国BD公司。

家兔，雌雄不拘，体重约1 kg，清洁级，杭州师范大学动物室提供。

2 方法

2.1 ASCs的来源和培养

家兔在利多卡因局部麻醉下，取出两侧腹沟处的脂肪组织，剪成颗粒状，匀浆，用0.075%胶原酶Ⅰ消化，过300目筛网，4℃，1 200 r/min离心5 min，弃去上层脂肪和上清液，再用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤沉淀组织3次，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基稀释，离心后取出沉淀组织。

将沉淀组织接种于培养瓶内，置37℃、5%CO2，饱和湿度恒温培养箱中培养24 h，之后倒去原培养液，PBS洗两次以去除未贴壁残渣。然后加入含15%胎牛血清的DMEM培养基继续培养，每周换液2次。当瓶壁基本长满了原代培养细胞时，用0.25%胰蛋白酶消化，进行传代培养。

2.2 ASCs的表型鉴定

取第3代ASCs，用免疫细胞化学法对ASCs的表面标记进行检测:加入抗体CD14、CD29、CD44和CD45，用流式细胞仪按说明书检测细胞表面特异性抗原。

2.3 不同浓度APS对细胞的增殖作用

选取生长良好的第3代细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，制成细胞悬液，将浓度调至2×109/L，培养瓶中的细胞接种于96孔培养板中。置于培养箱中培养24 h。随机分为对照组和实验组。对照组仅加培养液，实验组依次加入含有不同浓度的APS的培养液(1.95 ～1 000 μg/mL)，培养 48 h，考察浓度对增殖的影响。

2.4 不同时间不同浓度APS对细胞的增殖作用

取2.3项下的培养24 h的细胞，随机分为对照组和 ASP 25，50，100 μg/mL 组，对照组仅加培养液，ASP实验组分别加入相应浓度APS的培养液，分别培养24，48，72 h，考察浓度和作用时间对增殖的影响。

2.5 MTT比色法检测细胞的增殖

分别培养24，48和72 h之后，将浓度调为5×107/L，再分别将各孔细胞培养液转接种于96孔细胞培养板中，每孔含细胞悬液100 μL，每孔加入5 mg/mL MTT 溶液20 μL，在37 ℃、5%CO2条件下继续培养4 h，终止培养后弃上清液。每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150 μL，振荡混匀，充分溶解 MTT结晶物后，用酶联免疫检测仪检测在570 nm波长处的吸光度(A)值，倒置相差显微镜下观察细胞形态。

2.6 统计学处理

数据以(x±s)表示，使用 SPSS10.0 软件，用方差分析的方法比较组间差异。

3 结果

3.1 流式细胞仪表型分析结果

用第3代ASCs检测显示CD29和CD44为阳性，而CD14和CD45为阴性。

3.2 不同浓度APS对细胞的增殖作用

结果见表1。兔ASCs与APS培养后，APS的浓度不同，对细胞增殖有不同的影响。低浓度APS对细胞增殖无影响;而高浓度APS对细胞的增殖产生抑制作用。APS 浓度为 1.95 ～3.90 μg/mL 时，实验组与对照组比较，无显著差异(P＞0.05)，对细胞增殖无促进作用，倒置显微镜下见实验组细胞与对照组细胞大致相同，形态正常;而APS浓度为7.80～1 000 μg/mL时，实验组分别与对照组比较，均有显著差异(P＜0.01)，表现出明显的抑制作用，倒置显微镜下见实验组细胞变小，但未见明显坏死迹象，对照组细胞形态正常。

3.3 不同时间不同浓度APS对细胞的增殖结果

结果见表2。APS浓度在25～100 μg/mL范围内，培养24 h后实验组与对照组比较，均有显著差异(P＜0.05)，对ASCs的增殖有明显抑制作用。培养48和72 h后各组分别与对照组比较，均有极显著差异(P＜0.01)，显示对ASCs的增殖均有明显抑制作用。所以，APS在一定浓度范围内，浓度对细胞增殖的影响不大，而与培养的时间有关，随着作用时间的延长，对ASCs的抑制作用更加明显。

4 讨论

表1 48 h，不同浓度APS对ASCs增殖的影响(± s，n=4)Tab.1 The result of different concentrations of APS on proliferation of rabbit ASCs in vitro(± s，n=4)

表1 48 h，不同浓度APS对ASCs增殖的影响(± s，n=4)Tab.1 The result of different concentrations of APS on proliferation of rabbit ASCs in vitro(± s，n=4)

与对照组比较:1P＜0.01Compared with control group:1P ＜0.01

组别 浓度/(μg/mL) A值对照组 －1.057 ±0.037黄芪多糖组 1.95 0.938 ±0.092 3.90 0.995 ±0.040 7.80 0.966 ±0.0331 15.6 0.942 ±0.0301 31.2 0.910 ±0.0571 62.5 0.851 ±0.0391 125.0 0.680 ±0.0621 250.0 0.727 ±0.0421 500.0 0.439 ±0.0401 1 000.0 0.469 ±0.0291

APS对于细胞增殖的影响，目前争论较多。张仲平等［1］在研究APS对人骨髓细胞的增殖作用时发现，5 mg/L APS对人骨髓细胞粒单集落(CFUGM)和红细胞集落(CFU-E)的生成有促进作用，浓度过高或过低均无明显作用;对爆式红细胞集落(BFU-E)，则125 mg/L APS有显著作用，低浓度的APS没有作用。而许春姣等［2］在研究APS对犬骨基质干细胞增殖作用时发现，实验组无论APS浓度高低(0.005 ～0.05，50 mg/mL)，与对照组相比，第1，3天细胞呈增殖趋势;第5天除0.005 mg/mL组外，细胞呈抑制趋势。张朝阳等［3］的研究结果表明，0.2 mg/mL的APS对牙周膜细胞的增殖具有明显促进作用(P＜0.05)，而高浓度的 APS(0.4 mg/mL)对牙周膜细胞的增殖具有明显抑制作用(P＜0.05)。房信胜等［4］认为，APS在低浓度时表现出一定的促进细胞增殖作用，在高浓度时才表现出一定的抑制作用。

表2 不同时间APS对ASCs增殖的影响(± s，n=4)Tab.2 The result of different concentrations of APS on proliferation of rabbit ASCs at different time in vitro(± s，n=4)

表2 不同时间APS对ASCs增殖的影响(± s，n=4)Tab.2 The result of different concentrations of APS on proliferation of rabbit ASCs at different time in vitro(± s，n=4)

与对照组比较:1P ＜0.05，2P ＜0.01Compared with control group:1P ＜0.05，2P ＜0.01

组 别 浓度/(μg/mL)A 值24 h 48 h 72 h对照组 － 0.637 ±0.067 1.066 ±0.042 1.054 ±0.057黄芪多糖组 25 0.501 ±0.0391 0.717 ±0.0362 0.710 ±0.0372 50 0.495 ±0.0201 0.585 ±0.0152 0.576 ±0.0302 100 0.544 ±0.0301 0.544 ±0.0192 0.392 ±0.0402

本研究用MTT法测定不同浓度的APS对兔ASCs的增殖作用。48 h观察细胞，所加 APS在1.95 ～3.90 μg/mL 时，对 ASCs的增殖无促进作用，也无抑制作用;而 APS在7.8～1 000 μg/mL时，对ASCs的增殖有明显的抑制作用。而且，APS在25～100 μg/mL时，对细胞的增殖与细胞培养的时间有关，24 h时，APS对ASCs的增殖有抑制作用;48和72 h时，APS对ASCs增殖的抑制作用更明显。

综合以往报道，当APS浓度达到200 mg/L左右及以上，对细胞的增殖产生的一般为抑制作用;当APS浓度在100 mg/L左右及其以下，大多表现的是促进作用。本研究表明，APS浓度即便在100 mg/L以下，表现出的是既无促进作用，也无明显抑制作用。在张仲平等［1］的研究中也有类似的“低浓度的APS没有作用”的情形。

APS是黄芪的水提醇沉物，成分复杂，APS注射液质量标准主要考察多糖含量，但在已知的成分中除APS之外，还含黄芪甲苷、黄酮类以及氨基酸类等。黄芪产地的不同，采收时间的不同，选用部位的不同，都可能导致APS提取液中成分的不同和各成分含量的不同，因此，实验所用APS来源的不同，可能导致不同的结果。

本研究结果表明低浓度APS对ASCs的增殖无促进作用，也无抑制作用，较高浓度的APS对ASCs的增殖有抑制作用。高浓度的APS对ASCs增殖的抑制作用与大多数报道相似，但低浓度APS对细胞的增殖也无促进作用也无抑制作用，这种研究结果较为少见。具体原因有待进一步研究。

［1］张仲平，洪介民.黄芪多糖对体外人骨髓造血祖细胞生成的影响［J］.中药药理与临床，2000，16(1):16-17.

［2］许春姣，翦新春，郭 峰，等.黄芪多糖对犬骨基质干细胞增殖及超微结构的影响［J］.华西口腔医学杂志，2007，25(5):432-436.

［3］张朝阳，孔祥丽，陈思秀，等.黄芪多糖对牙周细胞增殖与结构的形态学影响［J］.华西口腔医学杂志，2010，28(5):556-559.

［4］房信胜，穆象山，周红英，等.黄芪皂苷和黄芪多糖对大鼠肾脏系膜膜细胞增殖的影响［J］.时珍国医国药，2008，19(6):1448-1449.