参附注射液对失血性休克家兔肠系膜上静脉缺血再灌注小肠黏膜损伤的保护作用

方 军，陶礼钧，吴作株，陈必成

(温州医学院 1.附属第一医院，2.实验动物中心，浙江 温州 325000)

随着交通事故增多，临床上肠系膜撕裂伤致肠系膜上静脉破裂合并失血性休克病例日渐增多，手术中需阻断肠系膜上静脉进行修补，因此小肠黏膜需承受失血性休克低灌注、静脉阻断无血流及开放后缺血再灌注三重损伤，可引起一系列肠道反应，激活肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-6、IL-1β 等细胞因子和炎症介质释放，并激活炎症细胞和毒性介质，导致肠黏膜通透性增加、屏障破坏、并发生细菌易位［1］。易位的细菌产生大量的内毒素并释放至血液，形成内毒素血症，并激活机体免疫炎症防御机制，导致自身中毒和组织损害;不仅如此，细菌和内毒素易位还导致胃肠黏膜局部免疫炎症系统的激活，细胞因子和其它免疫炎症介质产生，这些肠源性介质进一步加剧全身炎症反应，并导致肠通透性进一步升高，从而形成通透性升高－毒性介质的释放－通透性进一步升高的恶性循环，加剧全身炎症反应，引起机体各器官继发性损害，甚至多器官功能衰竭［2-3］。

本实验采用失血性休克动物模型模拟临床肠系膜上静脉破裂致失血性休克病例，观察失血性休克、静脉阻断及开放后缺血再灌注多重损伤对小肠黏膜结构和屏障功能的影响，并观察参附注射液对小肠黏膜的保护作用。

1 材料

参附注射液(10 mL/支，批号:080116)，雅安三九药业有限公司;丙二醛(MDA)试剂盒(批号:20080321)，南京建成生物工程研究所;鲎试剂(批号:080124)，厦门鲎试剂厂。

日本大白兔，体重 1.5 ～2.5 kg，雌雄不限，由余姚市泗门镇建飞实验兔养殖场提供，许可证号:SCXK(浙)2006-0026。

2 方法

2.1 动物模型建立与分组

日本大白兔30只，术前禁食12 h，自由饮水。3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)耳缘静脉注射麻醉，分离左侧颈总动脉，插管接多功能监护仪监测动脉压;分离右侧颈外静脉用于输液及给药，稳定10 min。随机分为正常对照组，模型对照组和参附注射液组。正常对照组:直接开腹取小肠标本，分离肠系膜上静脉取血液标本;模型对照组:经左颈总动脉放血使平均动脉压在10 min内降至50 mmHg，建立休克模型，并通过动脉放血和静脉回输，维持平均动脉压在50 mmHg水平，休克1 h后开腹，在开腹前30 min经右颈外静脉输注2.5 mL/kg生理盐水，开腹后分离出肠系膜上静脉，取休克1 h后肠系膜上静脉血样，并阻断肠系膜上静脉，同时开始回输自体血及等量生理盐水，纠正休克，5 min后开放阻断，1 h后取再灌注1 h肠系膜上静脉血样，取小肠样本;参附注射液组:除用2.5 mL/kg参附注射液代替生理盐水外，其余操作同模型对照组。

2.2 样品采集和测定

2.2.1 小肠病理学检查 距回盲部2 cm以上取回肠5 cm，常规固定、石蜡包埋、切片(3 ～4 μm)，HE染色。采用奥林巴斯BX41图像采集分析系统，观察3张非连续性切片，每张切片在图象分析仪上测定10个绒毛肠黏膜厚度、肠绒毛高度。取平均值。

2.2.2 MDA测定 模型对照组和参附注射液组分别于休克1 h后、再灌注1 h后取肠系膜上静脉血2 mL，3 000 r/min离心15 min，取血清低温保存。正常对照组于建立颈部插管10 min后即开腹取血。按试剂盒说明测定MDA含量。

2.2.3 血浆内毒素测定 模型对照组和参附注射液组分别于休克1 h后、再灌注1 h后取肠系膜上静脉血1 mL加抗凝剂1 mL，1 000 r/min离心10 min，取血浆，－18℃保存。正常对照组于建立颈部插管10 min后即开腹取血。采用偶氮鲎试剂基质显色法，按试剂盒说明操作，测定内毒素。

2.3 统计学处理

所有数据均用(x±s)表示。两组间差异的统计学比较采用两样本均数差别的显著性检验(t检验)，P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 小肠黏膜厚度和绒毛高度

结果见图1和表1。正常对照组绒毛排练有序，黏膜完整，无绒毛脱落坏死，模型对照组较正常对照组小肠黏膜厚度及绒毛高度明显下降(P＜0.01)，绒毛间距变宽，部分上皮细胞坏死脱落，部分顶端绒毛脱落。参附注射液组小肠黏膜厚度及绒毛高度较正常对照组明显下降(P＜0.01)，但较模型对照组有明显改善(P＜0.01)。

图1 正常对照组(A)、模型对照组(B)和参附注射液组(C)小肠病理切片(HE染色，×400)Fig.1 Slice of ileum of normal control group(A)，model control group(B)，and Shenfu Injection group(C)(HE staining，×400)

3.2 MDA及内毒素测定结果

结果见表2。模型对照组和参附注射液组休克1 h后血浆MDA及内毒素水平较正常对照组明显升高(P＜0.01)，经肠系膜上静脉阻断、再灌注1 h等损伤后两组血浆MDA及内毒素水平较休克1 h时再次明显升高(P＜0.01);相同时间点血浆MDA及内毒素水平参附注射液组较模型对照组显著下降(P ＜0.01 或0.05)。

表1 参附注射液对休克及肠系膜上静脉缺血再灌注家兔的小肠黏膜厚度和绒毛高度的影响(± s，n=10)Tab.1 Effects of Shenfu Injection on the ileum mucosa thickness and villus height endured haemorrhagic shock and superior mesenteric vein blocking(± s，n=10)

表1 参附注射液对休克及肠系膜上静脉缺血再灌注家兔的小肠黏膜厚度和绒毛高度的影响(± s，n=10)Tab.1 Effects of Shenfu Injection on the ileum mucosa thickness and villus height endured haemorrhagic shock and superior mesenteric vein blocking(± s，n=10)

与正常对照组比较:1P＜0.01;与模型对照组比较:2P＜0.01Compared with normal control:1P ＜0.01;Compared with model control:2P ＜0.01

组 别 黏膜厚度/μm 绒毛高度/μm正常对照组513.3 ±18.5 403.4 ±12.9模型对照组 432.9 ±27.51 298.2 ±17.71参附注射液组 469.5 ±12.81，2 365.3 ±10.91，2

4 讨论

参附注射液是红参与附子的提取物，其有效成分是人参皂苷和乌头类生物碱，参附注射液因其“多靶效应”广泛应用于临床抗休克、心律失常、心力衰竭甚至多器官功能障碍综合征(MODS)的救治;体外研究表明，它还能抑制小鼠肝癌H22细胞株的增殖和诱导细胞凋亡［4］。其可能的机制有:①延长耐受缺氧的时间，增加血供及氧合，改善再灌注组织微循环并调节细胞内2，3-二磷酸甘油酸水平，促进氧的释放与应用;②保护超氧化物岐化酶(SOD)活性抗脂质过氧化和灭活黄嘌呤氧化酶;③阻滞Ca2+通道，稳定细胞内Ca2+;④促进前列环素释放，抑制 TXA2合成，减弱炎性介质级联反应［5］。参附注射液注射后可有效改善组织的微循环状态，使能量和营养物质的供给增加，从而使组织细胞的功能得到改善。

表2 参附注射液对休克及肠系膜上静脉缺血再灌注家兔血浆MAD及内毒素水平的影响(± s，n=10)Tab.2 Effects of Shenfu Injection on the plasma MDA and endotoxin levels endured haemorrhagic shock and superior mesenteric vein blocking(± s，n=10)

表2 参附注射液对休克及肠系膜上静脉缺血再灌注家兔血浆MAD及内毒素水平的影响(± s，n=10)Tab.2 Effects of Shenfu Injection on the plasma MDA and endotoxin levels endured haemorrhagic shock and superior mesenteric vein blocking(± s，n=10)

与正常对照组比较:1P＜0.01;与模型对照组比较:2P＜0.01，3P＜0.05;与休克1 h时比较:4P＜0.01Compared with normal control:1P ＜0.01;Compared with model control:2P ＜0.01，3P ＜0.05;Compared with shock 1 h:4P ＜0.01

组 别 MDA/(nmol/L)休克1 h时 再灌注1 h时内毒素/(EU/mL)休克1 h时 再灌注1 h时正常对照组8.46 ±0.51 0.278 ±0.062模型对照组 14.40 ±0.801 20.07 ±0.911，4 0.440 ±0.0641 0.778 ±0.0841，4参附注射液组 11.06 ±0.871，2 16.10 ±0.791，2，4 0.350 ±0.0481，2 0.664 ±0.1031，3，4

本研究结果表明，在开腹前30 min给予参附注射液后，休克1 h后及再灌注1 h后血浆内毒素及MDA水平均较模型对照组明显下降，证实参附注射液在失血性休克及缺血-再灌注多个环节起到保护小肠黏膜结构和屏障功能的作用，推测和其改善微循环，调节免疫功能，保护血管内皮细胞，抗缺血、缺氧，清除氧自由基，抗脂质氧化反应等作用有关。

在缺血再灌注导致肠黏膜和屏障损伤的过程中，TNF-α起着十分重要的作用。TNF-α可激活中性粒细胞，促进中性粒细胞和内皮细胞表达众多的黏附分子，导致中性粒细胞在组织中的聚集，局部炎症反应加重，肠黏膜细胞坏死凋亡，黏膜屏障破坏，而参附注射液预处理能明显抑制血浆和肠组织中TNF-α水平的升高，从而阻断了由于早期TNF-α合成与释放增加而介导的一系列生物效应［6］。在缺血再灌注时肠道黏膜细胞凋亡数量大量增多，参附注射液能降低缺血再灌注肠细胞Bax蛋白表达，下调caspase-3表达，同时促进Bcl-2表达，从而抑制肠黏膜缺血再灌注时肠黏膜上皮细胞的异常凋亡，减轻肠黏膜缺血再灌注损伤［7］。这也可能是参附注射对肠道黏膜保护的另一种途径。

［1］Grotz M R，Deitch E A，Ding J，et al.Intestinal cytokine response after gut ischemia role of barrier failure［J］.Ann Surg，1999，229:478-486.

［2］Doig C J，Sutherland L R，Sandham J D，et al.Increased intestinal permeability is associated with the development of multiple organ dysfunction syndrome in critically ill ICU patient［J］.Am J Respir Crit Care Med，1998，158:444-451.

［3］田晓峰.肠缺血再灌注损伤对机体的影响［J］.医师进修杂志:外科版，2005，28(6):6-8.

［4］宁异真，谭宇蕙，吴映雅，等.参附注射液和高乌甲素对小鼠肝癌细胞H22生长抑制及诱导凋亡作用［J］.中国生化药物杂志，2007，28(6):375-377.

［5］徐 军，楼洪刚，楼宜嘉.参附注射液药理作用的研究进展［J］.上海中医药杂志，2008，42(10):87-89.

［6］胡 刚，刘先义，夏中元，等.参附注射液对大鼠肠缺血再灌注损伤防治作用的实验研究［J］.中华实用中西医杂志，2004，4(17):313-315.

［7］朱仁武，戴雍月，姜阳贵.参附注射液对大鼠肠缺血再灌注损伤后肠黏膜细胞凋亡的影响［J］.中国中西医结合外科杂志，2008，14(3):248-251.