珠海旋沟藻赤潮水样对其他微藻生长的影响

王朝晖，姜 珊，谷阳光，康 伟，冯 杰，林朗聪，邵 娟，张 珂

1)暨南大学水生生物研究所，广州510632;2)热带亚热带水生态工程教育部工程研究中心，广州510632

旋沟藻(Cochlodinium)是目前世界上扩展最快的有害赤潮生物，已在全球范围内引发赤潮，并造成严重危害.近10年，多环旋沟藻赤潮在全球迅速扩展，造成包括养殖鱼类和贝类在内的海洋生物大量死亡，并导致珊瑚礁的退化和破坏，2008-2009年在阿拉伯海湾发生的多环旋沟藻赤潮更是持续了10个月［1-4］.近年在中国华南沿海旋沟藻赤潮频繁发生.1990年福建沿海发生了一次旋沟藻(Cochlodinium sp.)赤潮［5］;2006年 4 月在珠江口桂山港和东澳岛码头附近海域发生了旋沟藻赤潮，造成人民币100万元的经济损失;同年10～11月旋沟藻赤潮又在珠江口内伶仃洋附近海域发生［6］;2007年6月和10月旋沟藻赤潮又分别在香港和深圳海域发生［7］.而2009年10月25～30日在珠海发生了面积超过300 km2的大规模旋沟藻赤潮，赤潮期间旋沟藻最大细胞密度达8.66×106L-1(http://www.gd.xinhuanet.com)，表明这种危害严重的赤潮已在我国扩展.

旋沟藻是一种有毒赤潮藻类，能产生包括神经性、溶血性和凝血性毒素等鱼毒素以及多聚糖［8-9］，北美和日本海域的多环旋沟藻对其他海洋浮游植物具有很强的克生作用［10-11］，且旋沟藻对其他海洋生物的毒性和克生作用在其种群竞争和赤潮发生中具有重要作用［10］.但目前有关中国沿海旋沟藻研究的报道多为赤潮事件的报道［5-6］，迄今尚未见生理生态学方面报道.为揭示旋沟藻的种群竞争优势，了解赤潮对海洋浮游植物群落结构的影响，作者采集了2009年珠海海域旋沟藻赤潮水样，研究旋沟藻赤潮对其他典型浮游植物生长的影响，以期为该藻类赤潮的防治提供参考.

1 材料与方法

1.1 赤潮水样采集与观察

2009年10月29日16∶00左右珠海赤潮高发期，在珠海渔女雕像附近海域采集赤潮带表层水样，并于2 h内迅速运回实验室处理.将水样充分混匀后，取一部分样品直接在显微镜下进行观察摄影;另取约20 mL水样，用鲁哥氏液进行固定，在显微镜下对浮游植物进行定性定量分析.

1.2 受试藻细胞的培养

受试藻类包括中肋骨条藻(Skeletonema costatum，硅藻)、海洋原甲藻(Prorocentrum micans，甲藻)和赤潮异弯藻(Heterosigma akasiwo，针胞藻)，这3种藻类为我国沿海常见赤潮藻类，均采自广东大亚湾海域，并在实验室进行分离培养.

采用f/2培养基，培养温度 (20±1)℃，光照强度5 000 lx，光暗比为12∶12.实验前，将对数生长期的藻细胞置于离心管中，在4℃以4 000 r/min离心5 min，收集备用.

1.3 实验设置

取1 800 mL赤潮水样3份，分别装入3个2 L的三角瓶中，分别进行4种处理.①A处理:一份水样用冰浴超声波破碎，并在显微镜下检查，直至细胞全部破碎，然后在100℃下水浴5 min;②B处理:另一份水样用GF/C滤膜过滤，得到无细胞滤液;③C处理:将B处理中滤膜上的藻细胞用高压蒸汽灭菌的珠海海域非赤潮带海水充分冲洗，直至冲洗干净，定容至1 800 mL，冰浴超声波破碎;④D处理:冰浴超声波破碎处理.以上4种处理水样均用GF/C滤膜过滤，得到的滤液用于实验.

对4种处理样品设4个稀释梯度，其中A、B、C和D表示用处理液原液配制成f/2培养基;A、B、C和D下面分母n表示用处理液稀释至n倍后配制成f/2培养基;另外设置f/2培养基作为对照组.培养基和稀释用水为珠海海域非赤潮带水样(预先经过GF/C滤膜过滤，并在121℃高压蒸汽灭菌15 min).

实验在250 mL三角瓶内进行，内盛100 mL不同处理的培养基，根据实验藻类细胞大小，加入中肋骨条藻、海洋原甲藻和赤潮异弯藻的初始细胞密度分别为9 000 mL-1、2 000 mL-1和6 000 mL-1左右.每个实验组设3个平行，培养条件同前.

1.4 实验观察

实验共进行14 d，每隔2 d对藻细胞计数1次.计数时，吸取藻培养液0.1 mL，置于1 mL计数框内，加入适量蒸馏水稀释，并用1滴福尔马林固定，在Leica DMIRB显微镜下计数.

2 实验结果

2.1 旋沟藻赤潮样品浮游植物分析

旋沟藻是赤潮水样中的优势浮游植物物种，细胞密度为 3.15×106L-1，占浮游植物总量的73.26%;血红哈卡藻(Akashiwo sanguinea)是第2优势物种，细胞密度和所占比例分别为6×105L-1和13.95%;环节环沟藻 (Gyrodinium instriatum)为第3优势物种，细胞密度和所占比例分别为7×104L-1和 0.93% .

在赤潮水样中共分析鉴定出18种甲藻，甲藻等有毒有害藻类的种类多样性和密度远高于该海域非赤潮期间的分析调查，如有毒有害甲藻哈曼褐多沟藻 (Pheopolykrikos harmannii)、黄金裸甲藻(Gymnodinium aureum)、米氏凯伦藻(Karenia mikomotoi)、异囊藻(Heterocapsa niei)、圆鳞异囊藻(Heterocapsa circularisquama)、塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)以及针胞藻日本纤囊藻(Fibrocapsa japonica)，一些在我国海域不常出现的异养型甲藻环沟藻(Gyrodinium pepo)、单眼藻(Warnowiapolyphenmus)和多沟藻(Polykrikos schwartzii)也频繁出现，而中肋骨条藻(Skeletonema costatum)、圆筛藻(Coscodiscus sp.)和细弱海链藻(Thalasiossira subtilis)等硅藻仅发现3种.

2.2 旋沟藻赤潮对藻细胞生长的影响

图1为4种处理赤潮水样对中肋骨条藻、海洋原甲藻和赤潮异弯藻生长的影响.由图1可见，旋沟藻赤潮水样对骨条藻生长影响较小，仅A和D两种处理在初期对骨条藻生长具有一定抑制，而B和C两种处理对藻细胞的生长则具有促进作用.

旋沟藻赤潮对海洋原甲藻和赤潮异弯藻的生长具有抑制作用，见图2和图3.A和D两种处理使海洋原甲藻几乎无法生存，原液至1/4稀释液中的藻细胞在培养的第2天就全部死亡，即使在1/8稀释液中，藻细胞也一直低于接种密度，在培养14 d后藻细胞全部死亡，如图2(a)和图2(d).赤潮异弯藻在A和D处理下的生长状况基本相近，只是1/8处理组中的藻细胞在培养第6天逐渐恢复活性，细胞快速生长，最终细胞密度接近甚至略超对照组的f/2培养基，如图3(a)和图3(d).A和D处理是经过了超声波破碎处理的赤潮水样，A处理还对处理液加热煮沸，结果表明，加热对赤潮水样中抑藻物质不具明显的破坏作用.

滤膜上的藻细胞 (C处理)对3种藻的生长均影响不大，如图1(c)、图2(c)和图3(c)，而无细胞滤液 (B处理)对海洋原甲藻和赤潮异弯藻的生长具有抑制作用，如图2(a)和图2(b).由此说明，旋沟藻赤潮水样对藻类具有抑制作用的物质是一种胞外产物，主要存在于水体或细胞培养液中.

3 讨 论

自1896年Schütt建立旋沟藻属以来，目前报道的旋沟藻属共有44个物种，其中多环旋沟藻是分布最广泛、研究较多的种类.珠海赤潮原因物种与世界上普遍引发赤潮的多环旋沟藻具有一定差异，估计与2006年在珠海海域发生旋沟藻赤潮原因物种为同一物种，初步定名为双胞旋沟藻(Cochlodinium geminatum)［6］.但有关该藻的正确命名尚需通过电子显微镜进行形态观察以及分子分类学进一步研究确定.

图2 不同处理的旋沟藻赤潮水样对海洋原甲藻生长的影响Fig.2 Effects of Cochlodinium bloom water samplesafter different treatments on the growthof Prorocentrum micans

本研究结果显示，旋沟藻赤潮对硅藻中肋骨条藻生长影响较小，但对其他两种鞭毛藻类海洋原甲藻和赤潮异弯藻生长有明显抑制作用.此结果与赤潮期间浮游植物观察结果吻合，本次调查取样为赤潮发生晚期，赤潮水样中的裸甲藻类如血红哈卡藻、环节环沟藻等密度较高，但其他浮游植物种类和数量均较少，而2006年的旋沟藻赤潮群落中仅有少量的骨条藻、海链藻、圆筛藻和叉角藻(Ceratium furca)存在［6］.说明旋沟藻可能对其他浮游植物具有一定的克生作用，而这种克生作用正是许多有毒有害赤潮藻类在种群竞争中取胜的重要生态决策［12］.北美株和日本株多环旋沟藻及其赤潮水样对其共存藻类血红哈卡藻、环节环沟藻等有强烈的克生作用，能在几分钟至24 h内使目标藻细胞失去游动性，并使细胞变形［10-11］.因此，尚不能断定珠海旋沟藻对其共存优势种是否具有克生作用，有关其与血红哈卡藻和环节环沟藻之间的关系尚需进一步研究.

图3 不同处理的旋沟藻赤潮水样对赤潮异弯藻生长的影响Fig.3 Effects of Cochlodinium bloom water samplesafter different treatments on the growthof Heterosigma akasiwo

在赤潮消亡期，由于赤潮生物的大量死亡，会向水体释放许多胞内物质，这些物质可能会对其他浮游植物的生长具有抑制或刺激作用.10月30日旋沟藻赤潮逐渐消亡，随后11月1日至6日即发生了中肋骨条藻水华.综上研究可知，旋沟藻细胞破碎液对骨条藻生长具有明显刺激作用.在珠海海域旋沟藻赤潮过后，骨条藻赤潮的发生可能与旋沟藻对其生长的刺激作用有一定关系.目前有关旋沟藻对共存赤潮藻类生长的促进作用尚未见报道，珠海赤潮水样对中肋骨条藻生长的刺激作用是本研究的新发现之一.

虽然目前的研究报道表明旋沟藻对藻细胞生长、活动能力与细胞形态均具有一定影响，但不同海域藻株产生的克生物质性质却不同［10-11］.北美株多环旋沟藻及其赤潮水样的克藻物质为一种不稳定的胞外产物，存在时间较短，冷冻、加热、超声波及过滤都使本次研究旋沟藻的克藻作用丧失［10］;日本九州海域的多环旋沟藻对血红哈卡藻的克生物质存在于细胞内，细胞间的直接接触是其产生克藻作用的前提条件［11］.本次研究旋沟藻赤潮水样中的抑藻物质主要存在于细胞滤液中，加热和超声波处理均不影响其抑藻作用，说明其产生的抑藻物质是一种具有水溶性和热稳定性的胞外产物.

本研究旨在了解旋沟藻及其赤潮对海洋浮游植物生长及群落结构的影响，采用旋沟藻赤潮水样作为研究材料，且所有的处理均未经过灭菌.藻际细菌作为海洋环境重要生物组成，其群落结构也会随优势物种及海洋环境的变化而变化，因此水样中的细菌也是本研究考量旋沟藻赤潮对其他浮游植物生长影响的重要方面，同时赤潮藻与藻际细菌的共同作用是有毒藻类水华发生与维持的重要因素［13］.在本研究中，旋沟藻赤潮水样对其他浮游植物生长的影响是旋沟藻、细菌及其他各种因子共同作用的结果，而旋沟藻的抑藻作用可能是其中较重要的因素.当然，如能够通过分离培养，得到旋沟藻株系，研究其纯培养物对其他藻类生长的影响，对于揭示旋沟藻的抑藻效应及作用机理具有更为重要的意义.但由于旋沟藻较难培养，且在实验室内很难达到自然水体中的赤潮密度［10-11］，本研究利用以旋沟藻为绝对优势物种的赤潮水样作为实验材料，也能在一定程度上反映它对其他浮游植物生长的影响.

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