PAMAM-D纳米载体介导TFinAODN防治心肌缺血再灌注脂质过氧化损伤的实验研究

李春海 宋 树英 桑 翠玲 李 文慧 尹俊

心肌遭受缺血损伤后恢复血流灌注，反而加重心肌损伤，称之为心肌缺血再灌注损伤。其表现为心肌水肿、氧利用能力下降、心肌收缩功能和细胞-容积调节作用减弱或丧失，心室顺应性下降。常伴有水、钠潴留，线粒体破碎，收缩带坏死，细胞膜断裂等。特别是细胞膜损伤后可致细胞内钙超载，严重的线粒体肌浆网状体内的钙积聚，可导致细胞的最终死亡［1］。心肌缺血再灌注损伤的发生机制与局部的炎性反应和凝血系统的激活有密切关系。研究发现，组织因子(tissue factor，TF)在缺血再灌注损伤的发生过程中起关键作用［2］。因而减少TF的合成与释放是防治缺血再灌注损伤的重要措施。本研究设计合成了针对大鼠TF的反义寡脱氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide，AODN)，利用聚酰胺-胺型树枝状高聚物 (polyamidoamine dendrimers，PAMAM-D)纳米载体介导 AODN转染至Lewis大鼠体内，观察了AODN对大鼠心肌缺血再灌注过程中脂质过氧化损伤的作用。

1 材料与方法

1.1 大鼠TF寡脱氧核苷酸序列合成 参考 Nakamura等［3，4］的报道，设计大鼠TF寡脱氧核苷酸，由TaKaRa宝生物工程有限公司合成，序列如下:反义寡脱氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide/TF，AS/TF):5’-CATGGGGATAGCCAT-3’(AODN);正义寡脱氧核苷酸(sense oligodeoxynucleotide/TF，S/TF):5’-ATGGCTATCCCCATG-3’(SODN对照);错配寡脱氧核苷酸(scrambled oligodeoxynucleotide/TF，Sc/TF):5 ’-TGACGCAGAGAGTCGTA-3’(无关ODN对照)。将上述3种寡脱氧核苷酸按电荷比1∶10藕联于G10代PAMAM-D纳米载体［购自Aldrich Chemical公司(Tokyo，Japan)］，构建 ODN-PAMAM-D 的聚合物。

1.2 动物分组 雄性 Lewis大鼠100只，体重230～280 g，随机等分为5组:假手术组(n=20):每只动物经尾静脉注入0.9%氯化钠溶液1 ml。缺血再灌注组(n=20):每只动物经尾静脉注入 PAMAM-D 12 mg/kg(溶于1ml 0.9%氯化钠溶液)。AS/TF防治组(n=20):每只动物经尾静脉注入AS/TFPAMAM-D 16 mg/kg(溶于1ml 0.9%氯化钠溶液，相当于AS/TF 4 mg/kg)。S/TF对照组(n=20):每只动物经尾静脉注入S/TF-PAMAM-D 16 mg/kg(溶于1 ml 0.9%氯化钠溶液，相当于S/TF 4 mg/kg)。Sc/TF对照组(n=20):每只动物经尾静脉注入Sc/TF-PAMAM-D 16 mg/kg(溶于1 ml 0.9%氯化钠溶液，相当于Sc/TF 4 mg/kg)。

1.3 制备心肌缺血再灌注损伤的动物模型 5组大鼠完成上述注射后10 h腹腔注射20%乌拉坦溶液(1.0 g/kg)麻醉。开胸暴露心脏，除假手术组以外的其他4组大鼠于冠状动脉左前降支中1/2处结扎造成心肌缺血，通过观察肢体Ⅱ导联心电图确定心肌缺血是否复制成功。心肌缺血90 min后，解除结扎，再灌注3 h。假手术组的大鼠开胸暴露心脏后，于冠状动脉左前降支中1/2处只穿线，不结扎，持续270 min。

1.4 标本取材及检测 分别于缺血90 min和再灌注结束后取各组大鼠的腹主动脉血液，采用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测肌钙蛋白T(troponin T，TnT)，并检测丙二醛(malonaldehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)的含量(检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，检测方法按配套说明书进行)。将梗死区及边缘区心肌组织剪下，一部分心肌组织用TRIzol提取RNA后，在1%琼脂糖变性胶中进行RNA甲醛变性电泳后，将RNA转移并固定于硝酸纤维素膜(nitrocellulose，NC膜)上，以标记有 α-32P dCTP的大鼠 TF cDNA作为探针进行Northern blot。经32P增感屏放射自显影后，Molecular Imager FX system观察结果，经Syngene图像分析系统进行图像扫描分析以确定各转录条带的强弱。另一部分心肌组织提取蛋白质后，采用一凝血法检测TF的促凝活性(tissue factor procoagulant activity，TF:C)，采用 ELISA检测 TF抗原(tissue factor antigen，TF:Ag)。心肌组织蛋白定量采用Lowry法。

1.5 统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件，进行完全随机化设计资料的ANOVA方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 5组大鼠血液中TnT和LDH的检测结果 心肌缺血90 min及再灌注3 h后，与假手术组相比各缺血再灌注组大鼠血液中的TnT和 LDH均显著增多(P ＜0.05或 ＜0.01)，而AS/TF防治组大鼠血液中的TnT和LDH则明显低于其他3个缺血再灌注组(P ＜0.05)。见表1。

表1 5组大鼠血液中TnT和LDH比较 n=20，±s

表1 5组大鼠血液中TnT和LDH比较 n=20，±s

2.2 5组大鼠血液中MDA的含量 心肌缺血90 min及再灌注3 h后，与假手术组相比5组大鼠血液中的MDA含量均明显增加(P＜0.05或 ＜0.01)，而AS/TF防治组大鼠血液中的MDA含量则显著低于其他3个缺血再灌注组(P＜0.01)。见表2。

2.3 5组大鼠血液中SOD的含量 心肌缺血90 min及再灌注3 h后，与假手术组相比5组大鼠血液中的SOD含量均明显减少(P ＜0.05或 ＜0.01)，而 AS/TF防治组大鼠血液中的 SOD含量则显著高于其他3个缺血再灌注组(P＜0.05或 ＜0.01)。见表 3。

2.4 5组大鼠血液中GSH-PX的含量 心肌缺血90 min及再灌注3 h后，与假手术组相比5组大鼠血液中的GSH-PX含量均明显减少(P ＜0.05或 ＜0.01)，而AS/TF防治组大鼠血液中的GSHPX含量则显著高于其他3个缺血再灌注组(P＜0.05)。见表4。

表2 5组大鼠血液中MDA的含量n=20，nmol/ml，±s

表2 5组大鼠血液中MDA的含量n=20，nmol/ml，±s

注:与假手术组比较，*P ＜0.05，#P ＜0.01;与缺血再灌注组比较，△P ＜0.01;与 AS/TF 防治组比较，☆P ＜0.01

组别 缺血前 缺血90min 再灌注3hrs假手术组13.7 ±2.5 13.9 ±2.5 13.8 ±2.5缺血再灌注组 13.5 ±2.2 26.5 ±4.3# 31.3 ±5.6#AS/TF 防治组 14.1±3.1 16.3±3.9＊△ 21.4±4.2#△S/TF 对照组 14.0 ±2.7 26.9 ±3.9#☆ 31.0 ±4.8#☆Sc/TF 对照组 13.8±2.1 27.0±3.7#☆ 31.2±5.2#☆

表3 5组大鼠血液中SOD的含量n=20，U/ml，±s

表3 5组大鼠血液中SOD的含量n=20，U/ml，±s

表4 5组大鼠血液中GSH-PX的含量n=20，mol/ml，±s

表4 5组大鼠血液中GSH-PX的含量n=20，mol/ml，±s

注:与假手术组比较，*P ＜0.05，#P ＜0.01;与缺血再灌注组比较，△P ＜0.05;与 AS/TF 防治组比较，☆P ＜0.05

组别 缺血前 缺血90min 再灌注3hrs假手术组55.2 ±5.7 54.9 ±5.8 53.9 ±5.2缺血再灌注组 54.9 ±6.2 39.1 ±3.0# 26.8 ±2.8#AS/TF 防治组 53.8±4.8 47.8±3.4＊△ 36.4±4.9#*S/TF 对照组 54.4 ±5.1 40.2 ±3.0#☆ 25.9 ±2.9#☆Sc/TF 对照组 53.9±5.7 39.7±2.4#☆ 26.3±2.0#☆

2.5 5组TF基因的转录 Northern Blot检测显示，心肌缺血再灌注3 h后，缺血再灌注的4组大鼠梗死区及边缘区心肌组织中的TF转录均强于假手术组，而AS/TF防治组大鼠梗死区及边缘区心肌组织中的TF转录则较其他3个缺血再灌注组明显减弱。见图1。

图1 5组TF基因的转录

2.6 5组大鼠心肌组织中TF的表达 缺血再灌注的各组大鼠梗死区及边缘区心肌组织中的TF:C和TF:Ag水平均高于假手术组(P＜0.01)，而AS/TF防治组大鼠梗死区及边缘区心肌组织中的TF:C和TF:Ag水平则明显低于其他3个缺血再灌注组(P ＜0.01)。见表5。

表5 5组大鼠心肌组织中的TF:C(U/mg蛋白)和TF:Ag(ng/mg蛋白)n=20，±s

表5 5组大鼠心肌组织中的TF:C(U/mg蛋白)和TF:Ag(ng/mg蛋白)n=20，±s

注:与假手术组比较，*P ＜0.01;与缺血再灌注组比较，#P ＜0.01;与AS/TF防治组比较，△P ＜0.01

组别 TF:C(U/mg蛋白) TF:Ag(ng/mg蛋白)2.5 ±0.5 11.0 ±1.5缺血再灌注组 63.3 ±5.8* 95.4 ±5.6*AS/TF 防治组 33.2 ±3.1*# 46.7 ±3.2*#S/TF对照组 62.7±5.2＊△ 93.3±5.2＊△Sc/TF对照组 65.6±6.0＊△ 96.3±6.0假手术组＊△

3 讨论

心肌缺血再灌注损伤是缺血性心脏病、冠状动脉搭桥手术、心脏移植等诸多疾病或治疗方法的重要病理生理过程，其发生机制与局部的凝血系统激活以及脂质过氧化损伤有着密切关系［5］。

心肌缺血后恢复血流灌注，缺血的组织重新供氧，可形成和激活一系列体液炎性介质，包括活性氧(超氧化物、氢氧自由基、过氧化氢等)、脂类介质［血小板活化因子(platelet active factor，PAF)、白三烯 B4(leukotriene B4，LTB4)］以及多肽类介质(补体C5A、细胞因子和黏附分子)等，从而引起炎性反应［6］。炎性反应可导致组织损伤，释放TF［7］。TF又称为凝血因子Ⅲ，主要存在于组织中的单核细胞和血管内皮细胞［8］。TF释放是血栓形成的始动因素。炎性反应损伤组织后引起TF释放，从而激活凝血系统，导致微循环内血栓形成，加重组织缺血缺氧［9］。

另一方面，心肌缺血再灌注过程中，血液流变学发生变化，使血液黏度增高和微循环内血流瘀滞，致使血管内皮细胞受损，也导致TF合成释放增加，诱发微循环内血栓形成。由此可见，TF释放在心肌缺血再灌注损伤的发生机制中起着关键作用。众多的研究都表明，心肌缺血再灌注过程中，血浆和局部组织中的 TF 水平均显著升高［10，11］。

鉴于TF在心肌缺血再灌注损伤过程中起着重要作用，那么将TF作为靶标，减少TF的合成与释放是防治心肌缺血再灌注损伤的主要措施。近年来，随着分子生物学技术的飞速发展，将AODN用于阻断TF基因的转录及表达已有零星报道。AODN具有特异性强、安全性好、操作简单、所需剂量小的优点［12］。Stephens等［13］在实验中观察到，TF 的 AODN 能够显著抑制人单核细胞TF基因的转录，并减轻由单核细胞释放TF而引起的炎性反应。后来Nakamura等［3，4］都发现，大鼠TF的反义脱氧寡核苷酸能够明显减轻其肝、肾的缺血再灌注损伤，降低病死率。但是，Nakamura和Matsuyama都是将TF的反义脱氧寡核苷酸直接注射入大鼠体内，AODN的长度一般都在10～20个碱基，由于片段短，直接注射入体内很容易被补体系统及各种酶所降解，不能稳定地发挥作用，导致疗效下降［14，15］。Lipofectamine能够提高反义脱氧寡核苷酸的转染效率，并延长其在体内的存在时间，但是它的毒性很大，因而限制了其在活体内的进一步应用［16］。

随着生物技术以及物理、化学等学科的迅猛发展，将纳米技术应用于医药学领域，开发纳米级的分子作为基因转移的载体用于携带AODN进行基因治疗已经成为可能。PAMAM-D是一类新近开发出来的纳米级基因转移的载体。初步的研究结果表明，PAMAM-D能够保护反义脱氧寡核苷酸不被血清或组织细胞中的补体及各种酶所破坏，而且效率明显高于传统的基因转移载体 Lipofectamine［17］。PAMAM-D属于非生物材料，没有免疫原性，不会引起机体的免疫反应;并且没有遗传毒性与细胞毒性，不会导致宿主的细胞转化和细胞死亡［18］。本实验中我们应用针对TF的反义寡脱氧核苷酸藕联于G10代PAMAM-D纳米载体，再将这一藕联物注射入大鼠体内，并结扎大鼠的冠状动脉左前降支，复制心肌缺血再灌注损伤的模型后，发现针对TF的反义寡脱氧核苷酸不仅抑制了TF的转录和表达，而且减少了过氧化脂质产物MDA的产生，也因此降低了SOD和GSH-PX减少的幅度，减轻了过氧化损伤。TnT和LDH是标识心肌损伤的敏感指标，实验中针对TF的AODN由于减轻了过氧化损伤，因而也改善了缺血再灌注损伤导致的TnT和LDH水平升高。因而PAMAM-D纳米载体介导的TF反义寡脱氧核苷酸对大鼠心肌缺血再灌注损伤有明显的防治作用。表明PAMAM-D纳米载体介导的TF AODN通过拮抗TF，抑制心肌缺血再灌注损伤过程中的凝血系统激活，从而减轻大鼠心肌缺血再灌注过程中的脂质过氧化损伤，对心肌缺血再灌注损伤有明显的保护作用。有关PAMAM-D纳米载体介导的TF AODN防治心肌缺血再灌注过程中脂质过氧化损伤的信号转导通路还有待于深入研究。

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