副溶血性弧菌REP－PCR分型研究

许龙岩 袁慕云 凌莉 黄华军 邹志飞

(广东出入境检验检疫局 广东广州 510623)

1 前言

经典的副溶血性弧菌(Vibrio Parahemolyticus，VP)分离培养和鉴定需要1－2周时间，人力物力花费大，不适应实际检验工作的需要。随着分子生物学技术的发展，分子水平上的分型与诊断方法以其敏感性高、特异性强、分型率和分辨率佳的优点，逐渐取代了传统的表型分型技术，在微生物的分型与诊断中发挥巨大的作用［1］。DiversiLab系统(DVL)是以基因外重复回文序列－PCR(Repetitive Extragenic Palindromic－ PCR，REP－PCR)技术为原理的自动化分子分型系统，已应用于原核和真核微生物的分子分型，包括具有重要流行病学意义的微生物如不动杆菌、肺炎链球菌、结核分枝杆菌和曲霉［2］。本研究用DVL系统对近几年从食品中分离的21株VP进行REP－PCR分子分型，掌握其在食品中的分子型别，并与PFGE结果相比较，探讨其对VP的分型能力，为VP的快速分型和溯源提供技术基础。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 试验菌株

食品中分离的VP 21株，为本实验室和中国检验检疫科学研究院食品所保存菌株，均用API 20E和VITEK2确认为VP，菌株信息见表1。PFGE分子量标准沙门氏菌H9812为本实验室保存菌株。

2.1.2 主要仪器和试剂

DVL系统、REP－PCR试剂盒及微流体芯片：法国梅里埃公司;

PTC－200型PCR仪、CHEF MAPPER脉冲场电泳仪、Gel Doc XR凝胶成像系统：美国Biorad公司;

一次性血琼脂平板：广州环凯公司。

2.2 方法

2.2.1 DNA 提取

用接种环刮取血平板上分离纯化的VP菌落，使用REP－PCR配套核酸提取试剂盒，按照厂家说明书推荐步骤提取 DNA，DNA浓度控制在25－50ng/uL。

2.2.2 REP －PCR 分型

以提取的VP DNA为模版，使用DVL配套的REP－PCR试剂盒进行PCR扩增，PCR循环参数为：94℃ 2min，94℃30s，50℃30s，70℃90s，35 个循环，70℃ 3min，反应体积为25uL。PCR扩增产物注入微流体芯片放入DVL系统进行电泳。DVL系统自动生成分析报告，包括聚类分析树状图、凝胶图像虚拟图、矩阵图。

2.2.3 PFGE 分型

21株VP中选择 VP1、VP3、VP5、VP8、VP9、VP10、VP16，共7株进行 PFGE分型，方法按照文献报道［3］进行，限制性内切酶用NotⅠ。电泳条件为起始转换时间为10.0s，最终转换时间为 32.5s，电泳时间18h。分子量标准沙门氏菌H9812的PFGE分型按照文献报道［4］进行。

3 结果

3.1 REP－PCR分型结果

DVL系统将21株VP分为16个群，菌株之间的相似度在64.5% －99.1%，VP21、VP10分布在1群，VP1、VP7分布在 2群，VP2、VP4在 3群，VP3、VP22在 11群，VP6、VP12在 15群，VP23、VP5、VP15、VP18、VP16、VP14、VP8、VP13、VP14、VP9、VP11分别分布在4群、5群、6群、7群、8群、9群、10群、12群、13群、14群、16群，详见图1。图1显示，分离自相同地区、相同食品中的VP分在同一个群。如VP1、VP7分离自广东无头冻虾，2株菌分在2群;VP2、VP4分离自广东出口冻虾仁，2株菌分在3群;VP6、VP12分离自广东地区冻虾仁，2株菌株分在15群。但也有发现分离自不同地区、不同食品中的VP分在同一个群中。如VP21分离自孟加拉冻墨鱼，VP10分离自广东虾，2株菌株分在1群;VP3、VP22分别分离自广东熟凤尾虾和生蚝，2株菌株分在11群。

3.2 REP－PCR与PFGE分型结果比较

7株VP用NotⅠ酶切PFGE电泳后，共有7个不同的PFGE型别，菌株之间相似度27.07% －84.37%，见图2。按照PFGE结果判断标准，7株VP是相互不相关的菌株;而 VP1、VP3、VP5、VP8、VP9、VP10、VP16在REP－PCR树状图上分别分布在2、11、5、10、14、1、8 不同的 7 个群中。

4 讨论

REP－PCR是以细菌DNA中串联重复序列为引物，对细菌基因组DNA进行扩增，得到指纹图谱并进行分析。WONG等研究评价了REP－PCR对副溶血性弧菌的分型方法，其分型能力与PAGE相当，优于核糖体分型方法，但其简捷性和实用性是PAGE 方法所无可比拟的［5，6］。DVL 是自动化的REP－PCR分型系统，该系统使用一个标准化算法，可以在4h内自动化分析13个样品，包括获得聚类分析树状图、凝胶图像虚拟图、矩阵图等报告，克服了手动REP－PCR实验室间重复性差，周转时间长，并且需要琼脂糖凝胶电泳进行DNA分离和检测的缺点，加快了细菌分子流行病学研究［7］。

图1 21株VP REP－PCR分型树状图和矩阵图

图2 7株VP PFGE分型聚类分析树状图

本研究用DVL系统对食品中分离的21株VP进行REP－PCR分型，结果21株VP分成16个群，REP－PCR型别分散，表现出较大的遗传多样性。这可能与样品来自不同地区和不同厂家，而且分离菌株的年份相隔较远有关。同时也发现，分别从相同食品中分离的VP1和 VP7、VP2和VP4、VP6和VP12，在聚类图上分别分在2、3、15群，而且菌株之间有不可分辨的REP－PCR型。这一结果提示，来自相同食品中的VP是否均有不可分辨的REPPCR型，DVL系统能否应用于食品中VP污染源的追踪、溯源，这有待于今后的进一步研究。

DVL系统对于REP－PCR分型结果的解释，厂家建议的判断标准是：相似性大于97%，没有条带的差异，判断为不可辨别的菌株;相似性大于95%，有1－2条不同的条带，判断为相似菌株;相似性小于95%，有多条不同的条带，则判断为不同菌株。但研究发现，在实际工作中对菌株进行分群时，要根据产生的电泳条带比较，在97%的水平上适当上调或下调相似性百分数，本研究是按上述原则，在菌株之间相似性为96.6%水平上对VP进行了分群。

虽然上述DVL系统的判断标准不够明确，但却具有简便、快速的特点，可广泛应用于分支杆菌、脑膜炎奈瑟菌、鲍曼不动杆菌的分子分型，为临床实验室提供了一个可靠的 REP－PCR 分型系统［8，9］。B.healy等(阪崎肠杆菌的新分类名)用DVL系统和PFGE对 Cronocacter菌属进行分型比较中发现，DVL系统把 C.malonatius和 C.dublinensis分在不同的群中进行REP－PCR聚类分析，比PFGE更能分辨一些分类群中菌株的关系，其种群分类能力比PFGE优胜［10］。本研究7株VP的 PFGE分型结果分析发现，7株PFGE型别不同、按PFGE判断标准彼此不相关的VP，在REP－PCR树状图上分别分布在7个不同的群中，而且7株VP按照DVL系统的判断标准也是不同的菌株，表明DVL系统在VP的分群能力和分辨率上与PFGE分型结果相似。

总之，在VP的分型方法中，DVL系统是一种快速、简便的分型方法，其种群分类能力和分辨率也比较高，可应用于VP的快速分型和溯源。

［1］董雪，王秋雨，金莉莉.副溶血性弧菌分子分型和检测研究进展［J］.中国卫生检验杂志，2008，18(2)：379 －381.

［2］T L Ross，W G Merz，M Farkosh.Comparison of an automated repetitive sequence－based PCR microbial typing system to pulsed－field gel electrophoresis for analysis of outbreaks of methicillinresistant staphylococcus aureus［J］.Journal of clinical microbiology，2005，43(11)：5642 －5647.

［3］Cooper K L，Luey C K，Bird M，et al.Development and validation of a pulse net standardized pulsed2field gel electrohoresis protocol for subtyping of vibrio cholerae［J］.Foodborne Patbog Dis，2006，3(1)：51 －58.

［4］许龙岩，袁幕云，刘静宇，等.进出口食品中沙门氏菌PFGE分型及耐药研究［J］.检验检疫科学，2010，20(2)：14 －17.

［5］WONG H C，LIN C H.Evaluation of Typing of Vibrio parahaemolyticus by Three PCR Methods Using Specific Primers［J］.J Clin Microbiol，2001，39(12)：4233－4240.

［6］金莉莉，董雪，王秋雨.副溶血性弧菌重复序列－PCR分型研究［J］.微生物学通报，2008，35(3)：389－394.

［7］Healy M，J Huong，T Bittner，et al.Microbial DNA typing by au-tomated repetitive－sequence－based PCR［J］.J Clin Microbiol，2005，43：199 －207.

［8］Cangelosi G A，R J Freeman，K N Lewis，et al.Evaluation of a high－throughput repetitive－sequence－based PCR system for DNA fingerprinting of Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium complex strains［J］.J Clin Microbiol，2004，42：2685－2693.

［9］曲燕燕，王文飞，周华，等.DiversiLab系统鲍曼不动杆菌基因分型可行性研究［J］.中华检医学杂志，2010，33(5)：425－429.

［10］B Healy，N Mullane，V Collin，et al.Evaluation of an automated repetitive sequence-based PCR system for subtyping Enterobacter sakazakii［J］.Journal of Food Protection，2008，71(7)：1372－1378.