苦参黄芪汤抗大鼠肝纤维化作用机制的研究

李 荣 李 蓉 西安市第五医院内三科 (西安 710082)

苦参黄芪汤具有活血化瘀,兼以扶正、益气、清热解毒、利湿退黄等作用,在临床应用多年,能有效治疗肝炎及肝硬化早期患者,但机理不明。本实验为探讨此中药方剂抗大鼠肝纤维化作用的机制,做了以下研究。

1 材料和方法 1.1 药物和主要试剂 苦参黄芪汤由黄芪 30g,鸡血藤 15g,黄芩、苦参各 10g组成,由西安中药厂制成粉剂。其中每克粉剂含生药 2g。兔抗鼠 TGF-β1多克隆抗体、PDGF-BB及 CTGF多克隆抗体购自武汉博士德生物公司。免疫组化 ElivisionTM Plus广谱试制盒购自福建迈新公司。

1.2 实验分组与处理 清洁剂雄性 Wistar大鼠 60只,购自第四军医大学动物实验中心,平均为 180 g。随机分为 4组:正常对照组(15只),除正常饮食、饮水外,每日给予 0.9%氯化钠灌胃,皮下注射花生油,量同模型组;模型组(15只),按《中药药物实验方法学》用复合因素造模[1],实验第 1天皮下注射40%CCl4花生油溶液 0.5mL/100g体重,以后每隔 3d,皮下注射 40%CCl4花生油溶液 0.3mL/100g体重,以 79.5%单纯面粉、20%猪油及 0.5%胆固醇配成混合饲料,自来水为唯一饮料饲养动物。10周后处死大鼠,分别取心脏血及收集肝脏标本;中药组(30只),造模方法同上,造模的同时给予中药灌胃。中药组分为大、小剂量组,每组 15只,大剂量组:每日给中药粉剂量 2 g/100 g体重;小剂量组:每日给予中药 0.5 g/100 g。以上2组,每日用药 1次,共 10周。 10周后处理同上。

1.3 检测方法 取大鼠心脏血由同位素科专人用放射免疫法测定大鼠血清中肝纤维化指标 PCⅢ、CIV、HA、LN的含量。各组大鼠肝组织标本行 M ASSON三色染色,光镜下观察。由同一病理医生予以纤维化分级并行定量分析。肝纤维化分期标准[2]。 0期:无胶原纤维形成;1期:汇管区扩大,显微组织将汇管区相连;2期:汇管区周围纤维化,纤维间隔形成,小叶结构保留;3期:汇管区与中央静脉之间出现广泛的纤维相连;4期:假小叶形成。应用免疫组化法观察 TGF-β1、CTGF、PDGFBB在肝细胞的着色情况,应用 Q550010型图像采集与分析系统,对各组切片随机选取 10个视野,在 20倍物镜下测量阴性细胞面积占肝脏视野面积的比,进行定量分析。

2 结 果 2.1 各组大鼠血清纤维化指标的比较 见表 1。

表1 各组大鼠血清肝纤维化指标变化比较(±s)单位:(g/L)

表1 各组大鼠血清肝纤维化指标变化比较(±s)单位:(g/L)

注:△与正常对照组比较 P＜0.05,▲与模型组比较 P＜0.05

组 别 n PCⅢ CⅣ HA LN正常对照组 15 13.2± 1.12 4.90± 0.62 104.36± 25.3 27.46± 6.56模型组△ 15 40.01± 0.52 20.56± 0.23 315.20± 98.39 70.11± 10.02小剂量组△▲ 15 34.20± 0.82 14.52± 0.42 185.20(18.21 59.54± 7.58大剂量组△▲ 15 19.56± 0.98 7.98± 0.91 137.25± 19.89 48.59± 9.82

与正常对照组相比,中药各组和模型组的血清肝纤维化指标均明显升高(P＜0.05);与模型组相比,中药各组肝纤维化指标明显降低(P＜0.05);不同剂量的中药各组比较,大剂量组优于小剂量组(P ＜0.05)。

2.2 光镜下组织形态学改变 见表 2。

表2 各组大鼠纤维化增生程度的比较

表3 各组大鼠纤维化定量分析结果(±s)单位:(m2/(m2× 100%

表3 各组大鼠纤维化定量分析结果(±s)单位:(m2/(m2× 100%

注:胶原面密度=胶原面积/肝组织视野面积×100%,△与正常对照组比较(P＜0.05)▲与模型组比较(P＜0.05)

组 别 n 胶原面密度正常对照组 15 4.83±2.78模型组 15 24.31± 3.55△小剂量组 15 18.02± 3.64△▲大剂量组 15 7.97± 1.06△▲

2.3 结果显示:与正常对照组相比,中药各组及模型组的胶原面密度明显增加(P＜0.05);与模型组相比,中药各组的胶原面密度明显下降,大剂量组优于小剂量组(P ＜0.05)。

2.4 各组大鼠肝组织中 TGF-B1、CTGF、PDGF-BB表达的比较,见表 4。

表4 各组大鼠肝组织中 TGF-B1、CTGF、PDGF-BB表达的比较(±s)um2/um2

表4 各组大鼠肝组织中 TGF-B1、CTGF、PDGF-BB表达的比较(±s)um2/um2

注:△与正常对照组比较(P＜0.05)▲与模型组比较(P＜0.05)

组 别 nTGF-β1CTGF PDGF-BB模型 组 15 0.61± 0.05 0.80± 0.02 0.61± 0.06△中药小剂量组 15 0.30±0.08 0.11± 0.05 0.41± 0.10△▲中药大剂量组 15 0.13±0.08 0.05± 0.09 0.18± 0.01△▲正常对照组 15 0.10±0.02 0.03±0.01 0.05±0.02

讨 论 现已证明,肝纤维化 (Hepatic fibrosis)是由各种原因造成肝细胞受损,使肝细胞外机制合成增多而降解减少,导致大量的纤维组织增生,最后发展为肝硬化。肝纤维化是各种慢性肝病发展为肝硬化的共同病理过程[3]。目前中医中药治疗肝纤维化,多从慢性肝炎及肝硬化的整体着手,以病机为基础,辨证施治。慢性肝病系因病既久,乘脾犯胃及肾,致肝、脾、肾俱损,气、血、水搏结,其关键在于肝脾血瘀。因此治则多以活血化瘀为基础,兼顾祛邪、扶正、补虚、健脾、益气、补肾[4]。苦参黄芪汤就是以“活血化瘀”为基本治则,兼以扶正、益气、清热解毒、利湿退黄,以多途径抗肝纤维化的形成。本次动物实验结果从血清学到肝组织病理学均证实苦参黄芪汤能有效的防治实验性大鼠肝纤维化的形成,其作用机制可能有以下几个方面:

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