磺胺二甲嘧啶人工抗原合成及单克隆抗体制备

李君华，吴 萌，李春生，齐颖颖，张小兵，闫静辉

（河北省科学院生物研究所，河北 石家庄 050081）

磺胺类药物（Sulfonamides，SAS）是具有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物的总称，在食源性动物的饲养中，被作为兽药广泛应用，在动物疾病防治方面具有显著的疗效[1]。磺胺二甲嘧啶（Sulfamethazine SM2），作为磺胺类药物的一种，具有性质稳定、抑菌谱广、毒性小、口服易吸收、价格低廉等特点，是畜牧业上应用最广泛、应用量最大的药物之一。但它在体内的作用时间和代谢时间较长，易残留在动物体内，并可通过食物等途径在人体中蓄积。药物蓄积浓度超过一定值对人体机能是有害的，长期蓄积则会导致磺胺类药物抗药性的产生，造成耐药菌的流行性感染，且有潜在的致癌性[2]。因此，欧盟对牛奶和肉类食品中的磺胺类药物制定了最高允许值，即磺胺类药物总量不得超过100 μg/kg，单个磺胺类药物的浓度不得超过25 μg/kg[3]。2002年12月我国农业部公告第235号文件规定：在所有食品动物的肌肉、脂肪、肝和肾中，磺胺类药物最高残留限量100 μg/kg，并将磺胺二甲嘧啶列为兽药残留监控的重点[4]。

磺胺二甲嘧啶属于小分子化合物，分子量为278.32，因为小分子本身不具有诱导产生抗体的能力，故必须将小分子与载体蛋白偶联合成出人工完全抗原，才能诱导产生抗体。本文旨在利用重氮化法合成抗原，以此制备出效价高、特异性强的单克隆抗体，为该药物的免疫学检测方法的建立奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

SM2，磺胺二甲嘧啶（Sulfamethazine SMT），纯度99%，Sigma；Sp2/0细胞（本研究室保存）；雌性BALB/c小鼠（河北实验动物中心）；牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumen，BSA），卵清白蛋白（Ovalbumin，OVA），HAT、HT、福氏佐剂、PEG4000、免疫球蛋白亚型试剂盒，均购自Sigma；细胞培养板、DMEM培养基，购自GIBCO公司；HRP标记羊抗小鼠IgG（北京中杉金桥生物科技有限公司）；亚硝酸钠，氨基磺酸等试剂均为分析纯。

1.1.1 仪器设备 酶联免疫检测仪（Tecan公司）；凝胶成像仪（SYNGENE）；CO2培养箱（SANYO）；倒置显微镜（Olympus）；U-3000紫外扫描仪（日本岛津）；722型可见分光光度计（上海分析仪器厂）；红外光谱仪（Thermo）。

1.2 方法

1.2.1 人工抗原合成 SM2-BSA完全抗原的合成采用重氮化法[5-6]并加以改进。称取55.6 mg的SM2溶于1 mL 1 mol/L的HCl中，并保持在4℃，称取15 mg亚硝酸钠溶于1 mL蒸馏水中，缓慢滴加入SM2溶液，边滴加边搅拌，保持pH值低于3。反应结束后用氨基磺酸消耗过量的亚硝酸，用淀粉碘化钾试纸检测，直至渗圈从深蓝色变成浅黄色为止。称取50 mg BSA溶于2 mL 1 mol/L pH值为9.6碳酸钠缓冲液中，即配成BSA溶液。在4℃放置1h后，将以上活化的SM2溶液逐滴加入BSA溶液中，反应过程中保持pH值为9，在4℃搅拌反应6 h后，用0.01 mol/L的PBS透析3 d，每天换液2次，即制备得SM2-BSA。SM2-OVA的制备亦按此方法。

1.2.2 人工抗原鉴定 SDS-PAGE鉴定：选择分离胶浓度为12%，浓缩胶为5%，对合成物进行SDSPAGE鉴定，并用紫外凝胶成像系统分析软件估算BSA与SM2的偶联比。

紫外光谱扫描（UV）鉴定：用PBS对SM2和BSA进行适当稀释，测定BSA的蛋白浓度，把SM2-BSA稀释到与BSA相同浓度，在220～400 nm波长下进行紫外扫描[7]。并根据式（1）计算偶联比[8]。

偶联比=（SM2含量/SM2分子质量）/（BSA含量/BSA分子质量） （1）

红外光谱（IR）鉴定：将 SM2、BSA、OVA、SM2-BSA、SM2-OVA的干粉与适量的KBr，在红外灯照射下研磨、混匀后压片，进行红外扫描。

1.3 单克隆抗体的制备及特性分析

1.3.1 单克隆抗体的制备 选用3只8周龄BALB/c小鼠，采用颈背部多点免疫，第一次免疫采用福氏完全佐剂，后面的免疫均采用福氏不完全佐剂，在免疫4次后，断尾取血，用间接ELISA法测定效价，选取最佳免疫小鼠进行融合[9-12]。取对数生长期的Sp2/0骨髓瘤细胞与免疫脾细胞，按常规方法进行融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔，利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，建立稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株，液氮保存，并将扩大培养的建株细胞注入致敏小鼠的腹腔，制备腹水。

1.3.2 单克隆抗体的特性分析 （1）SM2抗体的效价测定：采用间接ELISA法测定抗体的效价，用合成的SM2-OVA包被酶标板，以P/N 2.1时的单抗稀释倍数为此单抗的效价。（2）SM2抗体的敏感性测定[13]：采用阻断ELISA测定SM2 mAb对SM2的半数抑制浓度（IC50），以 IC50衡量敏感性。（3）SM2 抗体的亚型测定[14]：用Sigma公司的免疫球蛋白亚型试剂盒进行测定。（4）SM2抗体的亲和常数测定[9]：采用非竞争酶免疫法测定SM2的亲和常数。（5）SM2抗体的特异性测定：用阻断ELISA测定SM2的2株抗体与磺胺对甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺甲氧嗪、磺胺甲恶唑、磺胺六甲氧嘧啶、磺胺氯砒嗪等类似物的交叉反应率。

2 结果与分析

2.1 SDS-PAGE鉴定结果

由图1可知，SM2-BSA条带滞后于BSA，且带形有点散，明显区别于BSA，说明偶联成功。经紫外凝胶成像系统分析软件估算得：SM2-BSA的分子量为70KD，BSA的分子量为66.2KD，推算出偶联比为：14∶1，OVA-SM2 的偶联比为 10.5∶1。

图1 SDS-PAGE鉴定结果

2.2 紫外光谱扫描鉴定

由图2可知，BSA的最大吸收峰为278 nm，SM2的最大吸收峰为260 nm，SM2-BSA的最大吸收峰明显向左偏移，在240nm处，说明偶联成功。根据朗伯比尔定律（杨利国等）[8]，推算出偶联比为：13∶1，验证了 SDS-PAGE 的结果。

图2 紫外光谱扫描结果

2.3 红外光谱扫描鉴定

由图3～图5可知，在600～1 600的波数范围内，将SM2-BSA和BSA的特征曲线相比较，有明显不同，但与SM2的特征曲线有些相似，说明合成物中含有SM2。红外光谱扫描的结果可以证明SM2偶联到BSA上。

2.4 SM2单抗的效价测定

检测原SM2-OVA以浓度0.5 μg/mL的包被量包板，采用间接ELISA法测定SM2单抗的上清及腹水的效价，如表1所示，4H4和3A12两株腹水均具有较高的效价。

图3 SM2红外扫描谱图

图4 BSA红外扫描图

图5 SM2-BSA红外扫描图

表1 SM2上清及腹水的效价测定

2.5 SM2抗体的敏感性测定结果

用阻断ELISA法测定SM2抗体对不同浓度的SM2的抑制率，以抑制百分比B/B0（%）为纵坐标，SM2浓度的Log值为横坐标，绘制SM2抗体的标准抑制曲线。在0.5～40.5 ng/mL的范围内，线性关系良好，R2=0.996 2，3A12的 IC50为 0.6 ng/mL，表明对SM2具有较高的敏感性，见图6。4H4的IC50为1.8 ng/mL，见图7。

图6 阻断ELISA检测SM2-3A12 IC50

2.6 SM2单抗的免疫球蛋白亚型测定

图7 阻断ELISA检测SM2-4H4 IC50

用抗体亚型试剂盒进行鉴定，4H4为IgG2a,3A12为 IgG1。

2.7 SM2单抗的亲和常数测定

采用间接ELISA法测定SM2的亲和常数，以抗体浓度的对数为横坐标，以OD值为纵坐标，绘制 S 型曲线，K（3A12）=4.9×109L/mol，K（4H4）=8.3×108L/mol，这两株抗体的亲和力都较高。

2.8 SM2单抗的特异性测定

用阻断ELISA法测定SM2的2株抗体与磺胺对甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺甲氧嗪、磺胺甲恶唑、磺胺六甲氧嘧啶、磺胺氯砒嗪等类似物的交叉反应率，CR（%）均小于 0.1%（表 2）。

表2 SM2与7种磺胺类交叉反应结果

3 小结与讨论

传统的兽药残留分析主要是采用气相色谱、高效液相色谱、质谱等理化技术进行定性、定量分析，这些方法结果准确，但是存在前处理繁琐、仪器昂贵、专业化要求高等不足。与之比较，微生物法操作简便，但是特异性和灵敏度低。酶联免疫方法是基于抗原抗体特异性的免疫反应，灵敏度高，适用于大批量的样品检测，操作方便，对操作者的专业要求比较低[15]。本实验室通过重氮化法，合成制备了免疫原和检测原，通过免疫筛选出了具有高特异、高敏感的抗SM2的细胞株。建立以单克隆抗体为基础的药物残留检测体系，进而开发市场需要的药物残留ELISA检测试剂盒，这些内容需要在今后的工作中作进一步的研究。

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