二氯醋酸二异丙胺对重症胰腺炎肝脏损伤的保护机制研究

泸州医学院附属医院消化内科 (泸州 646000)刘 宏 邓明明 王何 彩

急性重症胰腺炎(Severe acute pancreatitis,SAP)是一种多系统疾病。 SAP不但累及胰腺,而且累及肝、肺及肾脏等远处器官[1]。肝脏是胰腺血液回流的第一站,病变胰腺释放大量炎症介质及蛋白酶在肝脏损害中也发挥一定作用。在病变加重时可发展成为肝衰竭,一旦肝功能衰竭发生就可导致多器官功能障碍(MODS)的发生,使患者的病死率明显的增加。大量的证据表明肝细胞过度凋亡可能是肝细胞功能衰竭的重要原因。细胞凋亡调控基因中最受关注的就是 Bcl-2,细胞色素 C及 fas家族。DADA是临床常用的保肝药,在胰腺炎肝脏损伤的治疗中有确切的临床疗效。本研究利用 SAP肝脏损害大鼠模型,探讨肝细胞凋亡和细胞色素 C、Bcl-2基因表达在 SAP肝脏损害发病机制中的作用以及应用 DADA治疗后的影响。

材料和方法

1 实验动物和分组 SD雄性大鼠 78只,体重250g～ 300g,由泸州医学院实验动物中心提供。随机分成四组:正常组 6只,假手术组 24只,SAP组 24只,DADA治疗组 24只。 每组再分为 12h、24h、48h、72h四个时间点,每个时间点分配 6只大鼠。

2 动物模型的制备 大鼠采用 3%戊巴比妥钠1ml/kg腹腔注射麻醉,平卧固定,取上腹横切口,将胃提出腹外翻转,使胰腺组织充分暴露,小动脉夹夹闭胰管近肝门部。SAP组及 DADA组用 4号针头于十二指肠乳头开口处刺破肠管进入胰管,依次向胰管开口方向推进,缓慢推注 5%牛磺胆酸钠 1ml/kg,使整个胰腺均匀隆起,去除动脉夹,退出针头关腹。DADA组于模型制备成功后,经尾静脉注射 DADA 0.375ml/(kg◦12h);SAP组尾静脉注射等剂量生理盐水;假手术组仅翻动胰腺组织周围的肠管随即关腹。造模后 12h、24h、48h、72h等各时间点处死大鼠,心脏穿刺抽血,快速切取肝脏组织,测定各项指标。

3 检测项目及方法

3.1 全自动生化分析仪测定 AST、ALT。

3.2 肝脏组织病理学观察各组织光镜标本以甲醛固定,常规石蜡包埋、HE染色,光镜观察。

3.3 肝脏细胞凋亡的测定:采用 DNA末端原位标记法(TUNEL法,试剂盒购自武汉博士德公司)。切片常规脱蜡入水,经 2%H2O2处理、蛋白酶 K消化后,加人 TDT和 Dig.dUTP 4℃过夜,封闭后加生物素化抗地高辛抗体 ,洗涤,加 SABC,DAB显色,光镜下计算肝脏细胞凋亡指数(Apoptotic Index,AI)。 AI计算方法:细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞,即凋亡细胞,数 4个高倍视野,分别计算凋亡细胞数和总细胞数,Al=凋亡细胞数 /总细胞数×100。

3.4 肝脏凋亡相关基因 Bcl-2、fas、细胞色素 C的测定采用 SABC免疫组化染色法(免疫组化试剂盒购自武汉博士德公司)。染色模式:胞膜或胞浆。①定性分析根据染色强度分为:阳性(棕黄色);弱阳性(浅黄色);阴性(不着色)。②定量分析各组切片均采用图像分析系统对免疫组化染色阳性反应产物进行定量分析。具体操作为:取切片在光学显微镜下以相同倍数(40×10)于肝组织随机选取 10个视野,利用图像分析系统分析阳性面积和阳性区域平均灰度值,并将阳性面积和平均灰度值按文献方法[2]换算成阳性单位(Positive unit,PU),以 PU值大小代表阳性产物表达的多少。

结 果

1 肝脏组织病理学改变

1.1 肉眼所见假手术组未见异常;SAP组 12h时腹腔见少量渗液,大网膜水肿,肝脏体积略增大,包膜正常;24h时腹腔内血性腹水增多,大网膜明显水肿并出现皂化,肝脏体积增大,包膜略紧张,与胰腺有少许的粘连;48h时腹腔内见大量血性腹水,大网膜、肠系膜大片皂化,肝脏体积增大,包膜紧张,颜色稍淡,与胰腺粘连明显,可见粘连部位肝脏组织坏死;72h时腹腔内见大量恶臭血性腹水,大网膜、肠系膜大片皂化,肝脏体积明显增大,包膜紧张,颜色明显变淡,与胰腺粘连较重,与胰腺粘连部位肝脏组织明显坏死;DADA组各时间点肝脏大体变化均较 SAP组明显减轻。

1.2 光镜下所见假手术组未见异常;SAP组 12h时肝细胞肿胀,细胞间隔增宽,少量炎细胞浸润;24h时肝脏组织脂肪变明显,肝细胞肿胀加重,细胞间隔增宽,间质内炎性细胞浸润,红细胞淤积;48h时可见局灶性或不规则片状肝细胞坏死,肝窦及汇管区周围大量炎性细胞浸润及红细胞淤积;72h时可见不规则片状或大片肝细胞坏死,肝窦及汇管区周围大量炎性细胞浸润及红细胞淤积;DADA组各时间点镜下所见均较 SAP组明显减轻。

2 AST、ALT的改变 SAP时 AST、ALT明显升高,且随着病程延长而逐渐增高;应用 DADA治疗后,AST、ALT明显下降,但仍有随着病程延长而逐渐增高的趋势,见表 1,2。

表1 各组大鼠血清 ALT变化(±s)

表1 各组大鼠血清 ALT变化(±s)

与 N组及假手术组比较,* P＜0.05;与 SAP组比较,▲ P＜0.05

ALT(U/L)组 别12h 24h 48h 72h N组 41.66± 4.59 41.66± 4.59 41.66± 4.59 41.66± 4.59假手术组 56.60± 6.02 55.63± 7.39 57.2± 9.07 54.53± 7.29 SAP组 206.35± 12.71* 248.93± 36.89* 302.33± 28.30* 317.57± 25.71*DADA组 126.30±40.31▲ 95.65±18.67▲ 87.53± 11.14▲ 60.40±22.24▲

表2 各组血清 AST变化(x-±s)

3 肝脏细胞凋亡情况 正常组及假手术组有极少量凋亡细胞,SAP组凋亡细胞明显增多,凋亡指数升高,并随着病程延长而逐渐增高,DADA组凋亡指数较 SAP组明显下降。各组肝脏组织细胞凋亡指数,见表 3。

表3 各组大鼠肝脏细胞凋亡指数(±s)

表3 各组大鼠肝脏细胞凋亡指数(±s)

与 N组及假手术组比较,* P＜0.05;与 SAP组比较,▲ P＜0.05

TUR组 别12h 24h 48h 72h N组 0.0046± 0.0007 0.0046± 0.0007 0.0046± 0.0007 0.0046± 0.0007假手术组 0.0052± 0.0010 0.0053± 0.0006 0.0053± 0.0005 0.0053± 0.0005 SAP组 0.0276± 0.0043* 0.0344± 0.0040* 0.0378± 0.0044* 0.0456± 0.0044*DADA组 0.0156± 0.0030▲ 0.0177±0.0022▲ 0.0174± 0.0021▲ 0.0123± 0.0032▲

4 肝脏细胞细胞色素 C、Bcl-2、Fas基因表达的变化 正常组及假手术组细胞色素 C、Bcl-2、Fas基因的表达均较弱;SAP组细胞色素 C、FAS基因有表达,尚随着病程延长而逐渐增高,Bcl-2表达值随着病程延长而逐渐下降;DADA组与 SAP组比较,细胞色素 C、Fas基因表达明显下调,而 Bcl-2基因表达明显上调。各组肝脏组织细胞色素 C、Bcl-2、fas表达,见表 4～ 6。

表4 各组大鼠肝脏细胞细胞色素 C表达(±s)

表4 各组大鼠肝脏细胞细胞色素 C表达(±s)

与 N组及假手术组比较,* P＜0.05;与 SAP组比较,▲ P＜0.05

细胞色素 C组 别12h 24h 48h 72h N组 0.0261± 0.0020 0.0261± 0.0020 0.0261± 0.0020 0.0261± 0.0020假手术组 0.0264± 0.0046 0.0228± 0.0029 0.0315± 0.0045 0.0289± 0.0021 SAP组 0.1057± 0.0136* 0.1608± 0.0095* 0.1878± 0.0148* 0.2161± 0.0181 DADA组 0.0735± 0.0053▲ 0.0630± 0.0059▲ 0.0778± 0.0065▲ 0.0587± 0.0083▲

表5 各组大鼠肝脏细胞 Bal-2表达(±s)

表5 各组大鼠肝脏细胞 Bal-2表达(±s)

与 N组及假手术组比较,* P＜0.05;与 SAP组比较,▲ P＜0.05

Bcl-2组 别12h 24h 48h 72h N组 0.0105± 0.0010 0.0105± 0.0010 0.0105± 0.0010 0.0105± 0.0010假手术组 0.0137± 0.0018 0.0119± 0.0026 0.0108± 0.0015 0.0095± 0.0016 SAP组 0.2066± 0.0128* 0.1465± 0.0216* 0.1377± 0.0423* 0.0798± 0.0329*DADA组 0.0932± 0.0588▲ 0.2999± 00.0356▲ 0.5734± 0.0866▲ 0.6291±0.0682▲

表6 各组大鼠肝脏细胞 Fas表达(x-±s)

讨 论

研究发现胰腺炎肝细胞损害的病理表现为光镜下可见肝细胞变性、散在的液化性坏死灶,库普弗细胞肿胀。电镜下可见糖原颗粒减少,但脂质小滴大小和数目增加;线粒体肿胀,其基质和嵴变性;自噬体和溶酶体增多;肝窦内皮损害伴吞噬细胞活性增加。 Isogai等[3]对 26例胆源性急性胰腺炎患者进行肝穿刺活检,大部分均有不同程度的肝脏损害。光镜下主要的组织病理学特征为散在的肝细胞坏死和急性胆管炎;电镜下可见肝细胞排列无序、胆小管扩张及胆汁潴留,部分区域的 Diss间隙尚可见肝细胞内容物。 Takeyama等[4]在体内以 20%脱氧胆酸钠(DCA)诱发大鼠 AP模型及健康大鼠腹腔注射胰腺炎相关性腹水(Pancreatitis associated ascitic fluid,PAAF)或在体外将不同浓度的 PAAF与原代肝细胞一起孵育,采用原位末端标记、琼脂糖凝胶电泳、细胞周期分析等技术检测,均发现肝细胞凋亡较对照组显著增多。

细胞的凋亡是受基因调控的,细胞凋亡的调控基因中最受关注的是 Fas/FasL基因和 Bax/Bcl-2。研究发现 AP时 Kupffer细胞衍生的 Fas配体(FasL1、p38-MAPK)、Caspase-3表达增加并且诱导了肝细胞的凋亡损伤[5,6]。推测 Fas/FasL在 AP肝细胞的凋亡中起关键作用。并认为 Kupffer细胞衍生的 Fas/FasL诱导的肝细胞凋亡和 NF-kappa B途径诱导的 Kupffer细胞凋亡之间的平衡失调程度决定了 AP时肝脏损伤的程度。

Bcl-2和 Bax都是 Bcl-2家族成员,Bcl-2的生理功能主要是抑制细胞凋亡,延长细胞寿命。 Bcl-2与Bax可形成同二聚体或异二聚体来改变线粒体的通透性,从而决定细胞的生存与死亡。当 Bcl-2相对量高于Bax时,Bcl-2同二聚体增多并促进形成 Bcl-2-Bax异二聚体,而 Bcl-2同二聚体和 Bcl-2-Bax异二聚体都可抑制细胞凋亡;相反当 Bax的量相对高于 Bc1-2时,则Bax同二聚体增多,从而促进细胞凋亡[7]。因而 Bcl-2/Bax两蛋白比例时决定细胞凋亡或存活的关键因素[8],而应用 DDFA(包括 D:地塞米松,D:低分子右旋糖酐,F:5-氟脲嘧啶,A:抑肽酶)治疗后,Bax基因表达明显下调,而 Bel-2基因表达明显上调,Bcl-2/Bax比值上升。因此认为,DDFA对肝功能的保护作用可能部分是通过调节凋亡相关基因 Bax和 Bcl-2从而影响细胞凋亡实现的[9]。

线粒体在肝细胞凋亡中发挥重要作用,细胞受到凋亡信号刺激后,线粒体发生肿胀,位于线粒体内外膜之间的通透性转换孔道(Mitochondriumpermeability transition pore,MPTP)开放,使线粒体外膜电位降低、破裂,线粒体内细胞色素 C(Cytochrome C,Cyt C)、凋亡诱导因子 (Apoptosis inducing factor,AIF)、Ca2+以及活性氧(Reactive oxygen species,ROS)等释放到胞质中,分别通过破坏核内染色质或激活 Caspase或作用于其它 Ca2+依赖性蛋白,而引起细胞凋亡。

线粒体通过释放出凋亡诱导因子和(或)细胞色素C诱导凋亡。如线粒体内膜发生损伤,则可导致线粒体功能的改变和肝细胞坏死。另外,一系列的单细胞的研究发现,在缺氧或高氧的情况下,激活线粒体的渗透转换能力能促进细胞死亡[10]。

DADA是临床常用的保肝药,临床疗效确切[11]。DADA的代谢产物有二异丙胺和甘氨酸,其中甘氨酸能通过甘氨酸裂解酶作用生成甲基四氢叶酸(N2H10-CH4-FH4),能为肝细胞代谢提供能量;通过激活丙酮酸脱氢酶(PDH)复合物以增加 PDH活性,增加葡萄糖氧化、促进三羧酸循环而改善肝细胞的能量代谢。同时另一代谢产物二异丙胺在三磷酸腺苷(AT P)活化作用下生成甲硫氨酸,甲硫氨酸与甲基四氢叶酸均可提供甲基,促进胆碱合成。胆碱与肝脂肪作用生成卵磷脂,生成的卵磷脂能促进膜磷脂的序贯甲基化,增强肝细胞膜的流动性,提高作为胆汁分泌和流动主要动力的钠-钾-AT P酶的活性,从而促进肝细胞再生。因此,能使受损肝细胞得到修复,同时提高组织细胞呼吸功能及氧利用率,提高脂肪酸的代谢活性,加速脂肪酸的氧化,并调节肝脏能量平衡,为肝脏功能恢复创造条件[12]。

有报道[13],D-氨基半乳糖氨所致中毒性肝损伤模型,其肝组织病理学和生化改变与人类病毒性肝炎相似。我们的实验发现,随着病程的进展大鼠肝细胞内的fas基因及细胞色素 C的表达明显的增加,同时细胞内的 Bcl-2表达是降低的这与大鼠的肝细胞凋亡增加肝功能的进一步恶化时一致的,肝细胞的凋亡与肝功能有着明显的相关性且随着肝细胞凋亡数目的增加肝功能进一步的恶化。说明胰腺炎的肝脏损害存在着肝细胞及线粒体的能量代谢障碍,而肝脏的损害至少部分是通过凋亡产生的。而采用 DADA治疗以后大鼠的肝功能得到明显的改善 AST、ALT明显的下调,同时细胞凋亡基因 fas、细胞色素 C表达明显的降低而凋亡抑制因子 Bcl-2表达明显的上调,病理结果显示肝脏损害明显的减轻,肝细胞凋亡指数也明显的降低;说明DADA能够改善肝细胞的能量代谢抑制细胞凋亡基因 fas、细胞色素 C的表达,促进凋亡抑制因子 Bcl-2的表达,促进肝细胞的修复,对 SAP导致的肝脏损害起到保护作用。

我们认为 SAP时随着肝细胞和线粒体能量代谢障碍 fas和细胞色素 C表达明显上升,Bcl-2的表达下调,肝脏凋亡细胞数增多,肝功能进一步恶化;DADA能够改善肝细胞及线粒体的能量代谢使细胞色素 C表达下调同时使凋亡基因 fas基因表达明显下调,而 Bcl-2基因表达明显上调,减少肝脏细胞凋亡可明显改善肝功能。因此认为,DADA对肝功能的保护作用可能部分是通过改善肝细胞代谢,调节凋亡相关基因 fas、细胞色素 C和 Bcl-2的表达来抑制 SAP时肝细胞的过度凋亡实现的。

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(注:*邓明明为本文通讯作者)