谷氨酰胺对肠粘膜上皮细胞合成多聚免疫球蛋白受体的影响

中国医科大学附属第一医院传染科 (沈阳 110001)崔 巍 孙翠明 刘 沛

sIgA是肠粘膜表面最重要的免疫防御因子,由浆细胞产生的 Ig A和肠上皮细胞产生的分泌片(Secretory component,SC)组装而成,能够抑制细菌粘附,在肠道局部免疫中发挥重要作用。有研究表明肠粘膜局部 sIg A减少是暴发性肝衰竭、烧伤、脓毒血症等多种疾病中促进细菌移位,诱发全身性炎症反应综合征的重要因素[1,2]。谷氨酰胺是目前为止最有效的肠粘膜保护剂,能够促进肠上皮细胞更新,维持肠上皮细胞的完整性。近年研究发现谷氨酰胺缺乏可以引起细菌移位[3],但是具体的作用机制还不十分清楚,是否与抑制 sIgA的产生有关目前还没有报道。因此本文观察了谷氨酰胺缺乏对肠上皮细胞合成分泌片的影响,以探讨谷氨酰胺在肠粘膜局部免疫功能中的作用。

材料与方法

1 材料选择

1.1 细胞株:Caco-2细胞株购自 American Type Culture Collection。

1.2 主要试剂:DM EM高糖培养基、FBS购自美国 GIBCO-BRL公司;非必须氨基酸购自美国 Hyclone公司;L-GLN、小鼠抗 SC多克隆抗体购自美国 Sigma公司;BCA蛋白定量试剂盒购自上海碧云天公司;RNA PCR试剂盒、T7体外转录试剂盒、Real time quantitive PCR试剂盒购自大连宝生物工程有限公司。

2 方 法

2.1 细胞培养:Caco-2细胞应用含有 200 ml/L胎牛血清、10 g/L非必须氨基酸、青霉素-链霉素双抗液和不同浓度的谷氨酰胺(0、0.1、1、4mM)的 DM EM培养液,在 37°C、50 ml/L CO2条件下进行培养,每 7 d按 1∶2的比例传代,传代后 7 d左右细胞生长达到融合,提取细胞蛋白或总 RNA进行后续实验。

2.2 Western blot:应用 RIPA裂解液裂解细胞,提取总蛋白;应用 BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量,具体方法按照说明书进行。将样品调成相同蛋白浓度,沸水煮 5min进行蛋白变性;每个样本取等量蛋白(约 50 μ g)进行 8%SDS-PAGE凝胶电泳 ,电压 100V,90min;电泳后将蛋白转至硝酸纤维素膜上,电压 50V,2h;脱脂奶粉封闭 2h,加入小鼠抗 SC抗体 (1∶1000)4℃过夜;然后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠-IgG抗体(1∶3000)室温 2h,ECL显色。以β-actin作为内参,结果通过天能图像分析系统进行分析,SC蛋白含量=样本 SC蛋白灰度值 /同一样本β-actin灰度值。

2.3 实时定量 PCR(Real time quantitative PCR):用 T RIZOL一步法提取细胞总 RNA。采用SYBR Green I荧光染料嵌合法检测 SC mRNA。简言之先构建目的基因(SC基因)和管家基因(GAPDH)的RNA标准品,制作标准曲线,利用标准曲线对样品中的目的基因和管家基因分别进行定量。通过管家基因的校正,检测各组细胞样本中 SC目的基因的相对表达量。SC mRNA的相对表达量 = SC基因拷贝数 /GAPDH基因拷贝数。 PCR反应体系的组成参照说明书进行,反应条件为逆转录反应 42℃10min,95℃2min,PCR扩增 95℃ 10 s1个循环 ,95℃5 s,60℃20s 45个循环。

SC和 GAPDH引物序列如下表,SC产物片段89bp,GAPDH产物片段 144bp。

SC-F 5'-TGTTGCCACCACTGAGAGCAC-3'SC-R 5'-CTT TGTAGGCCATCTCGGCTTC-3'GAPDH-F 5'-AAATGGTGAAGGTCGGTGTG-3'GAPDH-R 5'-TGAAGGGGTCGTTGATGG-3'

3 统计学分析 所有数据以 Mean±SD表示,应用 SPSS13.0,采用单因素方差分析(AVONA)的 LSD方法对各组间数据进行比较,以 P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 谷氨酰胺对肠上皮细胞 SC蛋白合成的影响(图 1):在 80 kDa处可见特异性蛋白条带,对各条带进行灰度分析发现:谷氨酰胺缺乏时,SC蛋白的相对含量为(0.28±0.02),逐渐增加培养液谷氨酰胺浓度后各组 SC蛋白的相对含量逐渐增加(0.33±0.03,0.88±0.02,1.02±0.03),差异具有统计学意义(P＜0.05)。提示谷氨酰胺的含量能够影响 Caco-2细胞 SC蛋白的合成。

图1 各组 SC蛋白 Western blot结果:可见随着 GLN浓度的逐渐增加,SC蛋白的相对含量增加(*与 GLN 0mM组相比P＜0.05)

2 谷氨酰胺对肠上皮细胞 SC m RNA表达的影响 (图 2):电泳结果和 OD值结果显示,构建的人 SC基因和 GAPDH基因 RNA标准品片段长度分别为342bp和 1043bp。其质量良好,所获得的标准曲线相关系数为 0.998,线性关系良好,融解曲线显示特异性良好。利用标准曲线对样品中的 SC基因和 GAPDH基因进行定量,结果发现随着谷氨酰胺浓度的增加,SC mRNA的表达量逐渐上调(1.0±0.01,1.13±0.06,1.39±0.04,1.48± 0.07),各组间差异具有统计学意义(P＜0.05)。提示谷氨酰胺的含量能够影响 Caco-2细胞 SC mRNA的表达。

图2 各组 SC mRNA检测结果:左图为 SC扩增曲线,下图为定量分析结果,可见随着 GLN浓度的增加,SC mRN A的表达量逐渐上调(*与 GLN 0mM组相比 P＜0.05)

讨 论

1988年 Wilmore等提出“肠道是应激的中心器官”学说,认为应激时肠管呈短暂或长时间的肠屏障功能损害,肠粘膜萎缩、通透性增加,细菌和毒素穿越肠粘膜屏障移行到肠系膜淋巴结或其他远处脏器形成细菌易位,促进了全身炎症反应综合征(Systemic inflammatory response syndrome,SIRS)的发生 ,通过一系列级联反应可最终导致多器官功能障碍综合征(Multiple organ dysfunction syndrome,MODS)[4]。

细菌和毒素穿越肠粘膜屏障必须首先粘附在肠上皮细胞上,这一过程与肠道局部免疫功能状态特别是sIg A密切相关。sIg A对肠道菌群尤其是 G-杆菌具有特殊的亲和力,能够包被细菌,封闭细菌与肠上皮细胞结合的特异部位,阻止其与肠上皮细胞粘附,避免细菌通过肠上皮细胞发生移位;sIgA还可中和肠道内的毒素、酶和病毒,并结合抗原分子形成免疫复合物,介导吞噬细胞清除病原微生物[5],因此 sIg A是维持正常肠粘膜屏障功能的重要环节。

GLN是目前最有效的肠粘膜保护剂,是生物大分子如嘌呤、嘧啶、核酸及蛋白质的重要氮和碳的前体,也是合成 ATP的前提,具有促进蛋白质合成和抑制蛋白质降解的作用,在维持肠道粘膜代谢、结构和功能方面发挥重要作用[6]。既往研究认为 GLN主要是通过加快肠上皮细胞更新速度,减少上皮细胞凋亡,从而维持完整的肠粘膜机械屏障来发挥作用[7,8]。近年来研究表明 GLN对肠粘膜免疫屏障亦有影响,表现为 GLN缺乏时肠道细菌包被率下降,细菌移位增加,补充GLN可以增加烧伤动物肠道局部 sIg A的含量[9],这些研究提示肠道免疫屏障也是 GLN影响肠粘膜屏障功能的一个重要靶点,因此我们应用体外细胞培养观察了 GLN对肠上皮细胞合成 sIgA的重要组成部分—SC的影响。

结果表明在 GLN缺乏情况下,肠上皮细胞只能合成较低含量的 SC,增加 GLN浓度到 1mM以上,SC蛋白含量明显增加。 SC是分泌性免疫系统的重要因子,参与 sIg A的形成和选择性上皮运输。SC由肠上皮细胞产生,与肠粘膜内 Ig A浆细胞分泌的聚合 Ig A结合后由肠上皮细胞以内化的方式携入胞内形成吞饮小泡,再转运至细胞顶端,以胞吐的方式释放入粘膜腔。结合的 SC能够降低 sIgA对肠腔内蛋白酶的敏感性;未结合的 SC称为游离 SC,De Araujo等研究发现,游离 SC是抵抗大肠杆菌的重要非特异性防御因素[10]。本研究结果提示 GLN缺乏时 SC合成减少,导致 sIg A的合成和转运障碍,由 SC介导的非特异性防御因素和分泌性免疫功能受到抑制,肠粘膜免疫屏障缺陷,最终引起细菌移位;补充 GLN能够纠正这一损伤,抑制细菌移位。

机体调节某种蛋白的合成,不外乎在转录水平或蛋白水平进行,为了明确 GLN影响 SC蛋白合成的作用环节,我们应用实时定量 PCR技术进一步检测了不同浓度 GLN对 SC mRNA合成的影响。结果表明:增加 GLN浓度可以上调 SC mRNA的表达,说明 GLN影响 SC蛋白的合成发生在转录水平,这为进一步研究 GLN影响 SC蛋白合成的信号通路提供基础。

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[3]Azuma H, Mishima S, Oda J,etal.Enteral supplementation enriched with glutamine,fiber,and oligosaccharide prevents gut translocation in a bacterial overgrowth model[J].J Trauma,2009,66(1):110-4.

[4]黎介寿.肠衰竭——概念、营养支持与肠粘膜屏障保护[J].肠外与肠内营养,2004,11(2):65-67.

[5]Corthsy B.Secretory immunoglobulin A:well beyond immune exclusion at mucosal surfaces [J].Immunopharmacol Immunotoxicol,2009,31(2):174-9.

[6]Tian J,Hao L,Chandra P,et al.Dietary glutamine and oral antibiotics each improve indexes of gut barrier function in rat short bowel syndrome[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2009,296(2):G348-55.

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[8]常淑婷,侯 情.谷氨酰胺对肝硬化患者肠道粘膜保护作用研究[J].陕西医学杂志,2010,39(11):1515-1517.

[9]Fan J,M engQ,Guo G,et al.Effects of enteral nutrition supplemented with glutamine on intestinal mucosal immunity in burned mice[J].Nutrition,2009,25(2):233-9.

[10]de Ara ú jo AN,Giugliano LG.Lactoferrin and free secretory component of human milk inhibit the adhesion of enteropathogenic Escherichia coli to HeLa cells[J].BM C Microbiol,2001,1:25.