Bcl-2 sh RN A慢病毒表达载体的构建与鉴定*

西安交通大学口腔医院 (西安 710004)饶国洲 李 昂 朱永进 齐 红 张引成

RNA干扰作用为实验研究提供了一种高效、快捷的抑制特异性基因表达的技术手段和工具,并有助于研究该基因在生物模型中的作用机制,以及肿瘤基因治疗研究的新策略。bcl-2是较早发现的一种重要的调亡抑制基因,研究表明 bcl-2基因的高表达与肿瘤的发生、发展及预后密切相关[1],由于 bcl-2具有独立耐药基因与抗凋亡基因从而导致对放、化疗的不敏感性[2],使得临床对肿瘤治疗效果不尽理想的原因之一。因此,本研究针对人 bcl-2基因序列设计 3个 siRNA靶点构建 shRN A慢病毒表达载体,拟通过封闭和下调 bcl-2基因的表达,促进其对放、化疗的敏感性及诱导肿瘤细胞发生凋亡,以达到肿瘤基因治疗的实验研究目的,为今后临床肿瘤治疗提供一种新的途径和方法。

材料与方法

1 材 料 主要试剂:带红色荧光报告基因pMAG(5.0)慢病毒载体(sb);E.coli DH5 α感受态细胞 (本 室 自 制 );Age I、EcoR I及 T4 DN A ligase(TaKaRa);PCR扩增试剂盒(Fermentas);质粒提取试剂盒(Promega);琼脂糖凝胶 DNA回收试剂盒(Promega)。主要仪器:核酸电泳仪(Amersham);PCR扩增仪(ABI 9700型);凝胶成像分析系统(USA);恒温培养箱(Thermo);恒温摇床(Fuma);台式低温高速离心机(Sigma)

2 方 法 ①si RNA靶序列设计:根据GenBank数据库中人 bcl-2序列 (NM-000633),选取 3个长度为 21bp的特异性寡核苷酸作为靶序列,编号为PLV T-240(CCGGGAGAT AGTGATGAAGTA);PLV T-241(GTGATGAAGTACATCCAT TAT);PLV T-242(T GGATGACT GAGT ACCTGAAC);选取其中一个序列打乱并无基因同源性作为阴性对照序列:PLVT-5(GGAGTACGGT AAGTAGAGTGA)。②病毒载体构建框架:以特异性寡核苷酸靶序列为摸板,按碱基互补配对原理,在两互补链之间设 CTCGAG作为 Loop环区,后接 T T TT TTG转录终止信号,5'端引入 Age I酶切位点,3'端引入 EcoR I酶切位点。按每个靶序列设计合成正、反义两条链组成特异性寡核苷酸链。 PLV T240正义链:5'-CCGGCCG GGAGATAGTGATGAAGT ACTCGAGT ACTTCA TCACTATCTCCCGGT TT TT Tg-3'反义链:5'-AAT TCAAAAAA CCGGGAGAT AGTGATGAAGTAC TCGAGT ACTTCATCACTATCTCCCGG-3'PLVT 241正义链):5'-CCGGGTGATGAAGT ACATCCAT T ATCTCGAGAT AATGGATGT ACT TCATCAC T T T TT Tg-3';反义链:5'-AATTCAAAAAAGTGAT GAAGTACATCCATT ATCTCGAGATAATGGAT GT ACTTCATCAC-3';PLV T242正义链:5'-CCGGT GGATGACTGAGTACCTGACCTCGAGAGT TCA GGTACTCAGTCATCCA T T TT TTg-3';反义链:5'-AATTCAAAAA TGGATGACTGAGT ACCT GA ACCTCAGAGGTTCAGGTACTCAGTCATCCA-3';PLV T5正义链:5'-CCGGGGAGTACGGTAAG T AGAGTGACTCGAGTCACTCTACT T ACCGT A CTCC T TT TT Tg-3';反义链:5,-AATTCAAAAAA GGAGTACGGT AAGTAGAGTGACTCGAGTCACT CT ACTT ACCGT ACTCC-3。 ③ DNA片段合成:将oligo用 oligo annealing buffer溶解成 20 μ M,互补单链各取 30 μ l混合,然后将 oligo混合物置 95℃水浴中加热 5min,取出冷却至室温,形成双链 oligo片段。取1 μ l用于后续连接反应,其余-20℃保存。④干扰片段连接入表达载体:用 Age I和 EcoR I双酶切 pM AGi质粒载体使其线性化,酶切产物电泳后回收约 7.48kb的载体片段。将退火的双链 oligo与线性化干扰载体连接,连接反应体系设阳性对照组(已验证片段),自连对照组,连接组。阳性对照组和连接组分别加 1 μ l退火双链 oligo(10mM),自连对照组不加。 3 μl线性化干扰载体 (40ng/μ l),2 μ l 10× T4 DNA ligase Buffer,1 μ l T4 DNA ligase,加 ddH2O至 20 μ l体系 ,于 16℃连接过夜。⑤重组质粒载体转化:取一支感受态细胞(每管100 μ l,-80℃保存 )于冰上 ,待溶解后加入 10 μ l连接液 ,轻轻旋转混匀内容物,在冰中放置 30min。将 EP管置42℃水浴中热激 90s。迅速将 EP管转移到冰浴中,使细胞冷却 3min。每管加 900 μ l LB培养液,置 37℃摇床上温育 1h使细菌复苏。将转化菌液涂布于含氨苄青霉素的 LB琼脂平板上。置于 37℃培养箱,16h。⑥阳性克隆鉴定:挑取平板上生长出的转化子重悬于 10 μ l LB培养液中,从中取 1 μ l做模板进行菌落 PCR鉴定。设计 PCR扩增引物为 primer(+):hU6-F(T ACGAT ACAAGGCTGT TAGAGAG);primer(-):M AGic-R(CT ATT AATAACT AATGCATGGC)。 PCR反应体系:13.7 μl H2O,2 μ l 10× Buffer(with Mg2+),1.6 μl dN TP(各 2.5mM),0.8 μ l primer(+)(10 μM),0.8 μl primer(-)(10 μ M),1 μ l Template,0.1 μ l Taq酶。 PCR循环反应按以下条件进行:94℃ 5min,(94℃ 30s、55℃30s、72℃ 30s)30cycle,72℃ 10min。 PCR产物做琼脂糖凝胶电泳,重组载体做 DNA测序鉴定。

结 果

1 PCR产物鉴定 分别取 5 μ l扩增产物,加 1 μl 6×上样缓冲液混匀上样,2.0%琼脂糖凝胶;10v/cm;1× TBE;25min。结果阳性克隆扩增出 335bp条带,阴性克隆扩增出 298bp条带,表明目的片段已插入载体中。 (见附图 )。

附图 PCR扩增产物电泳图

2 重组载体测序鉴定 将构建的重组载体阳性克隆送北京华大基因公司进行 DNA测序分析,测序结果中显示含有与设计相同的靶序列,表明 bcl-2慢病毒载体构建成功。下列阳性克隆测序结果分析中黄颜色并带下画线部分为设计的靶序列。PLVT240:T AGGGAATACT TTGACTGTAACACAAAGATA T TAGTACAAAATACGTGACGT AGAAAGT AAT AAT TTCTTGGGTAGT TTGCAGT TT TAAAAT T ATGT TT T AAAATGGACTATCATATGCT TACC GTAACT TGAAAGTAT T TCGATT TCT TGGCT T T ATAT ATCT TGTGGAAAGGACGAAACACCGG CCGGGAGAT AGTGATGAAGTAGT ACTCGAGT ACTTCATCACT ATCTCCCGGT TT T TTGT TAA AGAAT AT TT TGACTGTAACACAAAGAT ATT A GT ACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAAT AAT T TCT TGGGTAGTT TGCAGT:PLV T241:ATGGA T T ATT TGACTGT AACACAAAGAT AT TAGTAC AAAATACGTGACGTAGAAAGTAAT AAT TTCT T GGGT AGT TT GCAGT TT TAAAATT ACCGGGT GATGAAGT ACATCCATT ATCTCGAGAT AATG GATGT ACTTCATCACT TT TT TGTGT T TT AAA ATGGACT ATCAT ATGCT TACCGT AACTT GAA AGT ATT TCGAT TTCTTGGCTT TATAT ATCT T GTGGAAAGGACGAAACACCGGGTGATG。PLV T242:TGGGAATTGACTGTAACACAAAGATAT T AGTACAAAAT ACGT GACGT AGAAAGT AAT A ATT TCT TGGGT AGT T TGCAGT TT T AAAATT A T GTT TT AAAATGGACTATCATATGCTT ACCG T AACT TGAAAGTAT TTCGAT T TCT TGGCT TT ATAT ATCT TGTGGAAAGGACGAAACACCCCG GTGGATGACTGAGT ACCTGAACCTCGAGGTT CAGGTACTCAGTCATCCATT TT T TGGGTGGA T GACTACGTGACGT AG TGGATGACTG。PLVT 5:TACAAT ACGTGACGT AGAAGT AAT AATCT T GGT AGTGCAGT T TAAAT TAT GTT TAT GGAC T ATCATATGCT TAGT ACT TGAAAGT ATTCGA TCTT GCT T TAATGTACATGACTCCGGGGAGT ACGGTAAGTAGAGTGACTCGAGTCACTCT AC T T ACCGTACTCCTT TT TTGACATCTACGTAT T AGTCATCGCTATT ACCAT GGTGATGCGGT T T TGGCAGT ACATCAATGGGCGT GGAT AGCGG T TGT ACATGACCTT ATGGGACT TTCCTACT T GGCAGT。

讨 论

近些年来的研究发现[3,4],一些小的双链 RNA可以通过促使 m RNA的降解,并且高效特异性的阻断体内某种特定基因的表达。这种现象或过程被称为 RNA干扰 (RNA interference,RNAi)。因为 RNAi可以作为一种简单有效的替代基因敲除的工具,所以在功能基因组学研究方面以及基因治疗等领域,许多研究学者应用 RNA干扰通过抑制目的基因的表达来研究哺乳动物基因产物功能的有力工具[5,6]。

随着肿瘤分子生物学不断深入研究和发展以及RNA干扰技术的应用,bcl-2基因已作为肿瘤基因诊断与治疗的靶点。研究表明,肿瘤细胞中 bcl-2过量表达不仅与肿瘤的发生、发展及预后密切相关,而且使得肿瘤细胞耐药性增加。因此,有研究报道[7,8]应用反义寡核苷酸封闭 bcl-2基因的表达,从而导致其耐药性下降敏感性提高并促使肿瘤细胞凋亡。

由于体外合成反义寡核苷酸简便有效因而常被研究学者采用,但价格较贵且抑制时间短,通常不能用来进行长期的基因抑制研究是其的弱点所在。为此,本研究设计通过小干扰 RNA在体内表达一个短发夹 RNA(shRNA),这种 shRNA包含两个由一茎环序列分隔的反向重复序列,由 U6启动子控制,其中一个反向重复序列与目的基因互补。随后 shRNA被加工成siRNA,能够在哺乳动物细胞中持续表达 si RNA,从而降解目的基因 m RNA并抑制其表达,达到持久抑制基因表达的目的。基因抑制的有效性很大程度取决于目的基因序列的选择,本研究针对 bcl-2目的基因选取 3个长度为 21nt的特异性寡核苷酸作为靶序列,设计 3个 siRNA干扰靶点,分别连接入经 Age I和 EcoR I双酶切线性化的慢病毒质粒载体中,经过 PCR扩增产物经凝胶电泳后阳性克隆得到 335bp条带,阴性克隆得到 298 bp条带,证明设计的序列片段已插入载体中,DNA测序结果证实其含有设计合成序列。结果表明,成功构建了 shRNA表达载体。由于慢病毒载体能高效将目的基因或 RNAi导入动物和人的原代细胞或细胞系。与腺病毒不同的是,慢病毒能将目的基因整合到宿主细胞基因组中,并随细胞基因组分裂而分裂。能有效感染并整合到非分裂细胞中。本研究中使用的是“第三代”慢病毒载体,因此具有较好的安全性、靶向性,并为下一步的实验研究打下良好基础。

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