米诺环素调控小胶质细胞激活对PC12细胞生长的影响

钟健强 郭建军 卢 奎 沈庆煜，

1.广东省增城市人民医院神经科，广东增城 511300；2.中山大学附属第二医院神经科，广东广州510120

随着我国人口老龄化趋势的到来，帕金森病这一常见老年神经退行性疾病越来越受到研究者重视。近年来，众多研究报道小胶质细胞（microglia，MG）的激活参与中枢黑质纹状体炎症过程，从而加重帕金森病多巴胺能神经元的变性凋亡过程[1]。通过调控小胶质细胞激活状态而控制其后续的炎症反应成为近年来神经系统退行性疾病的研究热点。小胶质细胞在中枢组织中显示出强大的固有免疫功能，但其后续无控制的神经炎症在很多神经退行性疾病的损伤机制中起着推动作用。同样，MG的激活在帕金森氏病的神经元损伤中也存在类似的毒性效应，从而加重黑质纹状体通路多巴胺神经元变性。米诺环素（minocycline）属于四环素家族的广谱、二代半合成脂溶性抗生素。研究报道，米诺环素能有效抑制LPS刺激的MG激活，从而下调炎症因子TNF-α、IL-1β和NO的表达[2]。笔者设想，米诺环素能通过抑制MG激活引发的炎症反应从而减轻对多巴胺能神经元的损伤。PC12细胞的生物学特性类似于多巴胺能神经元，常作为帕金森病的离体研究模型。本实验拟通过米诺环素对LPS刺激后的小胶质细胞株BV2激活进行干预，进而观察干预BV2细胞对PC12细胞生长、增殖的影响，探讨米诺环素在MG对PC12细胞生长影响中的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂耗材

细胞培养所需的DMEM-F12培养基、胎牛血清、双抗、胰酶均购于GIBICO公司。LPS（L2880）、米诺环素（M9511）、二甲基亚砜（DMSO）购于美国Sigma公司；酶联免疫吸附法（ELISA）预包被试剂盒小鼠源TNF-α、IL-1检测试剂盒购于深圳达科为生物公司；四甲基偶氮唑盐（MTT）购于MBchem公司。6、96孔transwell共培养板购于corning公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养、分组和共培养 多巴胺能神经元细胞系PC12以及小胶质细胞系BV2均购于中国医学科学院基础所细胞中心。PC12细胞、BV2细胞的培养基均为含10%胎牛血清（FBS）的DMEM-F12培养基，培养基均已加入双抗（靑、链霉素），细胞置于5% CO2，37℃的细胞温箱培养。两种细胞均为贴壁生长，3～5 d传代1次。将BV2细胞接种于6孔（2×105cells/孔）、24孔（1×104cells/孔）和 96孔 transwell（5×103cells/孔）共培养板的上层板中，按如下因素进行BV2细胞分组：CON组，LPS组，LPS+MINO组。CON组：BV2细胞不加任何干预因素作为对照组；LPS组：BV2细胞培养液内加入LPS至终浓度为3 ng/mL，刺激约30 min后换掉含有LPS的培养液，清洗3遍；LPS+MINO组：BV2细胞培养液内加入LPS（同上组），在加LPS的同时加入米诺环素（终浓度至60 μmol/L）。将PC12细胞分别接种于6孔和96孔Transwell共培养板的下层板中，接种密度与对应BV2细胞相同，上下层板之间为半透膜，允许水分和中等大小的蛋白自由通过，使上下层细胞实现共培养。共培养24 h后，取各组上清液及下层板的PC12细胞做下一步实验。

1.2.2 ELISA法 检 测 TNF-α、IL-1β 表 达 6孔 Transwell共培养板中，实验各组分别设置3个复孔，分别提取各组上层板BV2细胞的上清液，采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定TNF-α、IL-1β的浓度。步骤严格按照厂商提供的说明书操作，最后在595 nm波长读取OD值，输入标准蛋白浓度，绘制标准曲线，计算出TNF-α、IL-1β的浓度。

1.2.3 四甲基偶氮唑盐法（MTT）检测PC12细胞存活率 各组生长有PC12细胞的96孔板下板，予200 μL/孔更换培养液，每组设6个复孔，并设与试验孔平行的本底对照孔，比色时以本底对照孔调零。每孔加入20 μL MTT至终浓度浓度0.5 mg/mL，在37℃培养箱内孵育4 h，弃培养液，加入150 μL DMSO，振荡仪振荡10 min，至紫色晶体颗粒充分溶解，酶标仪检测595 nm的OD值。细胞存活率=加药组A值/溶剂对照组A值×100%，并以6个复孔的平均值作为单个数据计算存活率。

1.3 统计学处理

实验数据资料应用SPSS17.0统计软件作统计学分析，计量资料用（± s）表示，多组资料间的比较采用单因素方差分析，处理组间的两两比较采用LSD-t检验，P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 共培养体系各组炎性因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）表达水平

通过ELISA实验测定共培养体系的炎症因子TNF-α和IL-1β表达水平见图1。共培养24 h后，LPS刺激MG后细胞外释放的TNF-α和IL-1β明显升高，在米诺环素干预后有所降低。与CON组比较，*P ＜0.01；与LPS组比较，#P ＜ 0.01。

图1 各组共培养液TNF-α、IL-1β表达量示意图

2.2 共培养体系各组PC12细胞存活率比较

对各组MTT检测结果进行单因素方差分析，各组间细胞存活率差异有统计学意义（F=58.64，P ＜0.01）。LPS组细胞存活率（43.58±1.87）%低于CON组（P ＜0.01）；LPS组细胞存活率（71.13±2.52）%高于LPS组（P ＜0.01）。见表1。

表1 MTT法检测各组细胞存活率（x ± s）

3 讨论

帕金森病是常见的老年中枢神经变性疾病，其病理改变为中脑黑质致密部多巴胺能神经元进行性变性丢失，纹状体区多巴胺水平下降，剩余的多巴胺能神经元内形成以α-突触共核蛋白（α-syn）为主的嗜酸性包涵体-路易氏小体（LB）[3]。近年来，很多研究表明免疫/炎性机制参与到帕金森病的发病机制中。Orr等[4]发现中枢黑质存在小胶质细胞的激活以及炎症因子的表达，由此推断帕金森病的发生发展可能与小胶质细胞过度激活引发的炎症反应有关。MG激活还能通过氧化应激促进多巴胺能神经元变性凋亡[5]。MG在脑组织中显示出强大的固有免疫功能，但其在免疫应答中释放出来的炎性因子严重的影响了神经元的活动及其信息处理能力[6]。

帕金森病传统的治疗方式大多为恢复中枢多巴胺递质水平，但亦不能阻止多巴胺能神经元的持续变性损害。抑制MG激活进而下调其黑质区后续的炎症反应成为治疗PD的一条新思路。米诺环素是第2代四环素类抗生素，并且是一种潜在的脑损伤神经保护剂，它很好的通过血脑屏障达到临床有效治疗浓度。米诺环素可以抑制γ-干扰素诱导的蛋白激酶磷酸化，进而抑制干扰素调节因子-1（IRF-1）基因易位而导致的Ⅱ类抗原反式激活因子（CIITA）增高，下调MHC-II导致静息状态MG的抗原呈递减少，最终降低MG的激活程度[7]。Filipovic等[8]研究表明米诺环素可以减少MG激活所致的神经元损伤以及降低BCL-2家族蛋白丢失转移所致的细胞凋亡率。但是，米诺环素能否用于调控黑质区域MG激活，更进一步抑制多巴胺能神经元变性凋亡呢？米诺环素能通过对抗线粒体功能抑制MPP+诱导的PC12细胞凋亡[9]，这说明米诺环素对PC12细胞的有着直接的保护效应，但是否通过MG介导PC12细胞损伤，尚未见文献报道。本实验采纳BV2与PC12共培养体系模拟体内MG和多巴胺能神经元的相互作用，并用经典的LPS刺激MG激活。共培养后，上清液中检测到TNF-α、IL-1β较未刺激的对照组明显升高。既往研究证实，TNF-α基因沉默小鼠可一定程度对抗MPTP毒性，说明TNF-α可协同MPTP对中枢多巴胺能神经元的毒性[10]。众多研究表明，IL-1β在帕金森病发生进展中发挥重要作用[11]。运用米诺环素抑制MG激活后，观察到后续的炎症介质TNF-α、IL-1β表达下降。炎症表达的下调直接降低了PC12细胞的凋亡，增加了其存活率，这证实了米诺环素可能通过抑制MG激活而下调TNF-α、IL-1β等炎症因子表达，从而保护PC12细胞，降低凋亡的发生率，促进中枢多巴胺/乙酰胆碱递质平衡。

综上所述，米诺环素抑制MG激活可下调其炎症表达，该效应可降低PC12细胞的凋亡发生，并提高其存活率，这对PD患者的治疗来说无疑是一种可尝试的新途径。但是，MG的激活是由多种外界因素以及内环境所导致的，调控PD的MG激活是否发挥主要治疗作用，是否存在更多的联合干预机制，这有待进一步研究证实。

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