PTEN基因在哮喘患者中的表达及地塞米松对其调节作用的研究﹡

倪振华 陈 果 陈清阁 王雄彪▲

1.上海市普陀区中心医院实验中心，上海 200062；2.上海市普陀区中心医院呼吸科，上海 200062

支气管哮喘是一种常见病，其患病率不低，并有逐渐增高的趋势[1]。第10号染色体上磷酸酶和张力蛋白同源缺失的基 因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）是近年来新发现的一个与哮喘发病相关的基因[2]，目前已证明在OVA诱发的哮喘大鼠模型中，PTEN蛋白表达和活性均降低，而给予糖皮质激素地塞米松治疗能促进PTEN的表达，抑制炎性细胞因子的分泌[3]。但是目前关于PTEN基因与哮喘的发病关系以及地塞米松对其的调节研究主要集中在哮喘动物上，尽管PTEN基因在人和鼠中高度同源，但是否在哮喘患者中也存在类似的关系，目前与此相关的研究国内外尚无报道。因此本研究拟通过测定哮喘患者和非哮喘患者气道黏膜组织中PTEN基因的表达变化，探讨PTEN在人哮喘发病中的关系，通过采用人气道上皮细胞A549探讨地塞米松对PTEN的表达调节，揭示地塞米松治疗哮喘的新途径。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2010年6月～2011年6月上海市普陀区中心医院收住院的5例支气管哮喘患者作为研究对象，其中男4例，女1例，年龄30～45岁，均符合中华医学会制定的支气管哮喘诊断标准，所有患者于入选前1个月内均未使用糖皮质激素治疗。正常对照组选取住院的非哮喘患者，其中男4例，女2例，年龄30～45岁。气道黏膜组织取自支纤镜黏膜活检。

1.2 主要试剂

RNA提取试剂盒购购自Qiagen公司，逆转录试剂盒购自Invitrogen公司，引物和探针由上海闪晶公司合成，荧光定量PCR试剂购自Roche公司。人气道上皮细胞A549购自中科院细胞所。地塞米松购自上海医药（集团）有限公司信谊制药总厂。

1.3 方法

1.3.1 荧光定量PCR检测PTEN基因的表达 RNA 的提取采用Qiagen公司的RNeasy Micro Kit 试剂，按说明书操作方法进行。cDNA合成采用Invitrogen公司SuperScript Ⅲ第一链合成试剂盒，按说明书操作方法进行。荧光定量PCR反应试剂采用 Roche公司 PCR master mix，反应条件为：94℃ 10 min，94℃30 s，60℃ 1 min，共40个循环，ABI7300全自动荧光定量PCR仪（美国ABI公司），以GAPDH基因作为内参，引物和探针序列 如 下：PTEN-F 5- GGGACGAACTGGTGTAATGATATG-3；PTEN-R 5- ATAGCGCCTCTGACTGGGAATAG-3；PTEN-Probe 5-fam- CCCTTTTTGTCTCTGGTCCTTACTTCCCC-tamra-3；GADPH-F 5- CCACTCCTCCACCTTTGAC-3；GADPH-R 5- ACCCTGTTGCTGTAGCCA -3；GADPH-Probe：5-fam- TTGCCCTCAACGACCACTTTGTC-tamra-3。

1.3.2 细胞培养 人气道上皮细胞A549用RPMI-1640培养液（含10%小牛血清），在37℃、5% CO2的条件下培养，隔天换液。取对数生长期细胞，用1640培养基制成细胞悬液 （1×l06个/mL ）加入6孔板，2 mL/孔，培养24 h后给不同浓度的地塞米松处理。

1.4 统计学处理

采用REST-XL软件和统计学软件SPSS11.0作为基因表达的相对定量统计学分析[4]，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PTEN基因在哮喘患者中的表达情况分析

本实验共提取5例哮喘患者和6例非哮喘患者气道黏膜组织的RNA，采用荧光定量PCR检测了PTEN基因的表达情况，实验结果通过REST软件分析显示PTEN基因在哮喘患者中的表达低于非哮喘患者（下降3.784倍），两组的差异具有统计学意义（P ＜ 0.05）。

2.2 地塞米松对PTEN的表达调节

分别采用不同浓度的地塞米松（10-5M、10-6M、10-7M和 10-8M）处理A549细胞24 h，提取RNA后采用荧光定量PCR检测PTEN基因的表达情况，结果显示地塞米松能上调PTEN基因的表达水平，呈浓度依赖性（P＜0.01，图1A）。再以10-5M浓度的地塞米松分别处理A549细胞24、48、72和96 h，结果显示随着地塞米松处理时间的延长，PTEN基因的表达逐步上升，具有一定的时间依赖性（P＜ 0.01，图 1B）。

图1 地塞米松处理A549细胞对PTEN表达的影响，A：不同浓度的地塞米松（10-5M、10-8M）处理A549细胞24 h；B：10-5M浓度的地塞米松处理A549细胞24～96 h。与对照组比较，*P ＜0.01

3 讨论

第10号染色体同源缺失性磷酸酶-张力蛋白基因（PTEN）是于1997年发现的一个具有磷酸酶活性的抑癌基因，研究发现PTEN不仅与肺癌的发生、发展关系密切，与其他呼吸系统疾病，如支气管哮喘等也有一定关系。在卵蛋白（OVA）诱发的哮喘小鼠模型中，PTEN蛋白表达和活性均降低。在给予PI3K抑制剂或PTEN腺病毒cDNA后，可明显减少气道炎症[2]，即上调PTEN表达能治疗哮喘。在过敏原诱发的哮喘小鼠模型给予PPAR-r促效剂或PPAR-r腺病毒后，PTEN表达上调。通过测量Akt磷酸化水平的减少发现该上调与PI3K活性降低有关[5]。该实验表明PPAR-r在哮喘发病学中，通过调节PTEN表达而起到保护作用。本实验结果显示在哮喘患者的气道黏膜组织中PTEN的表达也是下调的，与动物实验的结果一致，进一步说明PTEN在哮喘发病中发挥了重要作用，PTEN可以作为哮喘治疗靶点之一。

糖皮质激素地塞米松在治疗哮喘方面的一线作用已毋庸置疑，其可抑制多种炎症细胞的活化和炎症因子的生成及释放，降低血管通透性，提高β2受体的敏感性，对于哮喘的急性炎症及慢性气道重塑都有肯定的疗效。研究发现地塞米松治疗哮喘大鼠后，PTEN表达明显上调，提示地塞米松可能通过调节PTEN的表达从而发挥哮喘治疗的作用。本实验也在人气道上皮细胞上证实地塞米松能上调PTEN的表达，本研究结果显示地塞米松治疗哮喘的新途径。

综上所述，通过检测哮喘动物和哮喘患者中PTEN基因的表达情况揭示了PTEN在哮喘发病机制中的重要作用，正向调控PTEN可能是哮喘治疗的新途径。

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