黄心夜合的遗传多样性研究

朱秀志，张 华，侯志平

(赣南医学院基础医学院，江西 赣州 341000)

黄心夜合的遗传多样性研究

朱秀志，张 华，侯志平

(赣南医学院基础医学院，江西 赣州 341000)

运用随机扩增多态DNA(RAPD)技术，对黄心夜合［Michelia martinii(Levl．)Levl．］自然分布区的6个自然种群遗传多样性进行了研究。从100个随机引物中筛选出能产生清晰、稳定的多态性标记引物18个，共检测出110个位点，其中多态性位点为96个，占87.27%;在物种水平上，有效等位基因数目(Ne)，Nei’s基因多样性系数(He)和Shannon表型多样性指数(I)分别为1.735 2，0.416 3和0.597 1;总的遗传变异量(Ht)为0.339 8，其中居群内遗传变异量(Hs)为0.258 7，各居群间的遗传分化系数(Gst)达到0.323 1.应用UPGMA法对遗传距离进行聚类分析并构建树系图，结果表明:黄心夜合自然种群具有较高的遗传多样性，其种群间的遗传差异与其地理分布有关。

黄心夜合;遗传多样性;RAPD;DNA

遗传多样性是反映种质材料遗传多样性的有效指标。随机扩增多态DNA(RAPD)作为一种简便、快速、易行的分子标记，是探索生物居群的遗传结构和研究生物遗传多样性及系统进化的重要手段。黄心夜合［Michelia martinii(Levl．)Levl．］，别名夜合花，木兰科含笑属乔木树种。因其材质优良，多被采伐，故现存数量稀少。目前，有关黄心夜合在DNA水平上的遗传多样性研究尚未见报道。笔者对黄心夜合不同种群和种群内遗传多样性做RAPD分析，了解其种群层次上的遗传多样性水平，为进一步合理保护、利用与开发其遗传资源提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

材料采自四川省沐川县凉风坳森林公园、洪雅县高庙乡、平武县宽坝林场、峨眉山观心坡、雷波县凉山和重庆市金佛山黄草坪，共6个自然种群。每个种群采集4株～16株个体，植株间隔至少20 m．采集到的新鲜叶片用活性变色硅胶快速干燥，带回实验室放于－80℃冰箱保存备用。

1.2 研究方法

1.2.1 植物基因组DNA提取

采用改良的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法，将提取液中加入适量聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)和β-巯基乙醇，对植物基因组DNA进行提取。提取过程中动作要迅速，尽量减少样品与空气的接触时间。提取后用冷的纯酒精沉淀，发现沉淀物立即用细玻璃棒挑出。晾干后，测定DNA浓度和纯度，并通过琼脂糖电泳检查DNA的完整性，于－20℃保存备用。

1.2.2 引物筛选结果

随机引物采用上海生工公司引物(OD=2)，共100个引物(S1～S20;S41～S60;S81～S100;S161～S170;S261～S270;S351～S360;S501～S510)，经预备试验选择重复性强且能产生多态性、清晰明亮谱带的18个引物，对所有个体DNA进行扩增。各引物序列及检测带数见表1.

表118个RAPD引物对黄心夜合各居群DNA模板的扩增结果 个

1.2.3 RAPD扩增反应

根据Taguchi法优化的结果对几个主要因子的优化比较，确定了PCR的扩增反应在25 uL反应体积中的优化反应体系成分为:1.5 mmol/L Mg2+，0.8 mmol/L dNTP，240 nmol/L 随机引物，80 ng DNA，1.0 U Taq DNA聚合酶(上海生工公司)，1倍的buffer溶液。扩增的热循环参数设定如下:94℃变性3 min 20 s，1个循环;94℃变性1 min，36℃退火1 min，72℃延长2 min，45个循环;72℃延长10 min，1个循环。设定仪器自动转入4℃以保存扩增产物等待检测。

1.2.4 PCR产物检测

取10 uL扩增产物在含有0.5 ug/mL EB(溴化乙锭)的1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳缓冲液为1×TBE，稳压90 V，电泳0.5 h．电泳结果在紫外分析仪中观察、记录、拍照。

1.2.5 数据处理

每一随机引物重复1次，根据各标记的迁移率及其有无进行1/0记录，能重复出现且稳定、清晰的RAPD条带记为1，不出现的条带记为0，强带、弱带的赋值均为1.记录过程遵循以下原则:只记录易于辨认的条带，模糊不清的条带予以排除;电泳道中无法准确标识的条带不记录;迁移率相同但强度不同的条带，当强带的强度超过弱带的1.5倍时，不视为相同的条带，而是把它们分别计算。最后得到的数据输入POPGENE32软件进行分析。遗传距离(D)另按Nei's等的方法计算:

其中:S——任意两样本之间的遗传相似系数;

Nx，Ny——样本x和样本y扩增出的DNA片段总数;

Nxy——样本x和样本y共有的DNA片段数。

根据遗传距离对各居群进行UPGMA聚类分析，构建居群间亲缘关系分支树系图。

2 结果与分析

2.1 RAPD产物的多态性

不同引物扩增出来的带数不同，18个引物共扩增出110条带，长度在300 bp～2 100 bp之间，每个引物产生2条～9条。扩增条带的多少与含量不成正相关关系，平均每个引物约产生6.11条带。其中96条扩增带具有多态性，占PCR扩增带总数的87.27%，与黄山花楸、天目木兰、三棱栎等相比，比值较高，但与中国芸芥、乐昌含笑、海南粗榧及珙桐等物种的多样性条带百分比值接近。据此推测，黄心夜合物种水平上的遗传多样性背景较为复杂，遗传变异水平较高。

2.2 遗传多样性和居群分化程度

基于18条RAPD引物所扩增出的多态条带，利用POPGENE32软件在假设遗传平衡时计算有效等位基因数(Ne)，Nei’s基因多样性(He)和Shannon表型指数(I)等指标见第15页表2.

表2 黄心夜合遗传多样性与居群遗传结构

由表2可知，在物种水平上，有效等位基因数目(Ne)，Nei’s基因多样性系数(He)和 Shannon表型多样性指数(I)分别为1.735 2，0.416 3和0.597 1，比乐昌含笑高。总的遗传变异量(Ht)为0.339 8，其中居群内遗传变异量(Hs)为0.258 7，各居群间的遗传分化系数(Gst)达到0.323 1，即在总的遗传变异中有32.31%的变异存在于居群间，各居群已出现较强的遗传分化。

2.3 居群遗传距离

群体间RAPD片段共享性(即遗传相似度)能够在一定程度上反映群体间DNA的差异。根据每个引物在6个黄心夜合样本DNA的扩增结果，算出6个样本RAPD片段的平均遗传相似度。根据遗传相似度计算出遗传距离，见表3.

表3 任意2个居群间的遗传距离

根据遗传距离应用POPGENE32软件对各居群进行UPGMA聚类分析，构建居群间亲缘关系分支树系图，见图1.

由图1看出，洪雅居群与其它居群的遗传距离最大，可能与生境被破坏有关。除洪雅居群，可以把供试的其它5个黄心夜合材料聚为两大类群:东部的重庆金佛山居群和西部的四川居群，后者包括平武居群、沐川居群、峨眉山居群以及雷波居群。

3 讨论

图1 黄心夜合居群间的遗传距离聚类分析

笔者首次利用RAPD技术对黄心夜合种群进行了遗传多样性分析，结果表明，黄心夜合具有较高的遗传多样性。洪雅高庙乡黄心夜合居群的RAPD产物条带数少，多态性条带百分比值小，遗传多样性指数也小，与其它居群遗传距离较远，可能与生境被破坏有关。聚类结果显示，东部重庆金佛山居群和西部四川居群被归为两类，这一结果也真实地反映了两地黄心夜合植株在外观形态上的差异，两类居群之间表现出较大的遗传差异与它们的地理距离相关，即较远的金佛山居群与其它地方的居群遗传距离较大。

遗传多样性是反映种质材料遗传多样性的有效指标。黄心夜合目前尚未濒危，其遗传多样性指数较高，遗传差异较大，在品种改良中有较大的遗传潜力。有效保护并维持黄心夜合的遗传多样性，有助于其适应环境变化。而且保护黄心夜合的基因资源，也是遗传改良工作的基础。

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Study on Genetic Diversity of Michelia martini

Zhu Xiuzhi，Zhang Hua，Hou Zhiping
(Basic Medical College，Gannan Medical University，341000 Ganzhou，China)

The genetic variations of six natural populations of Michelia martini from different distribution regions were investigated at the DNA level by employing RAPD．Out of 100 random primers，eighteen random primers were screened，which could generate highly reproducible and clear RAPD fragments for further population analysis ．With these primers，a total of 110 discernible DNA fragments were obtained and of which 96(87.27%)were polymorphic，At species level，the effective number of allele(Ne)was 1.735 2．Nei's gene diversity(He)was 0.416 3 and Shannon index(I)was 0.597 1．Total genetic diversity(Ht)was 0.339 8，and the genetic diversity within populations(Hs)was 0.258 7．The coefficient of gene differentiation(Gst)among populations was 0.323 1．UPGMA map were made according to the genetic similarity and distance of the six populations calculated in this article．The result showed that M．martini had a high genetic diversity．The genetic diversity of M．martini among the six natural populations is primarily related to their geographic distribution．

Michelia martini;genetic diversity;RAPD;DNA

S792.99

A

1007-726X(2011)04-0013-04

2011-09-21

朱秀志(1973— )，男，安徽玉河人，2006年毕业于西华师范大学，讲师。