牛黄化毒片的质量标准研究*

刘 冰，王 佳，苗淑杰

( 1.天津市药品检验所，天津 300070； 2.天津同仁堂集团股份有限公司，天津 300385 )

牛黄化毒片收载于《卫生部药品标准中药成方制剂第二十册》，执行标准为WS3-B-3567-98。该药是由天南星(制)、连翘、金银花、白芷、甘草、乳香、没药、人工牛黄8味药材组成，有解毒消肿，散结止痛的功效，可以用于疮疡、乳痈、红肿疼痛的治疗。现执行的质量标准仅规定了性状及绿原酸的薄层色谱鉴别和检查项，而其中白芷具有祛风湿，活血排脓，生肌止痛的功效。为有效地控制药品质量，本文增加了连翘、甘草和人工牛黄的薄层鉴别方法，及白芷中欧前胡素的含量测定方法。修订后的标准可用于牛黄化毒片的质量控制。

1 仪器与试药

Agilent 1100高效液相色谱仪(包括在线脱气机、四元泵、自动进样系统、DAD检测器、Chem Stations色谱工作站)。连翘对照药材(批号120908-200613)、甘草对照药材(批号120904-200512)、胆酸对照品(批号100078-200414) 、猪去氧胆酸对照品(批号100087-200610)和欧前胡素对照品(批号为110826-200712，供含量测定用，含量99.9%)均由中国药品生物制品检定所提供。乙腈为色谱纯，水为去离子水。高效硅胶G薄层板(山东烟台化学工业研究所，批号070316)。牛黄化毒片样品(天津市同仁堂股份有限公司提供，批号为584004、783001、788002、889002)。

2 薄层色谱鉴别

2.1连翘的鉴别

2．1．1溶液制备

2.1.1.1供试品溶液的制备 分别取本品6片，除去包衣，研细，加甲醇15 ml，超声处理15 min，滤过，滤液作为供试品溶液。

2.1．1.2对照药材溶液的制备 连翘对照药材0.5 g，加甲醇10 ml，加热回流20 min，滤过，滤液作为对照药材溶液。

2.1.1．3阴性对照溶液的制备 按处方配比(连翘除外) 根据制法制成的阴性样品，取阴性样品粉末1.8 g，加甲醇15 ml，照“2．1．1.1”项下方法提取，作为阴性对照溶液。

2.1.2薄层条件与结果 照薄层色谱法(《中国药典)2005年版一部附录Ⅵ B)试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液及阴性对照溶液各6～8 μl ，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇(5∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照溶液无干扰。见图1。

2.2甘草的鉴别

2.2.1溶液制备

2.2.1.1供试品溶液的制备 分别取本品16片，除去包衣，研细，加甲醇20 ml超声30 min，滤过，滤液挥干，加水20 ml溶解，滤过，滤液加乙酸乙酯萃取2次,每次15 ml，挥干乙酸乙酯层，残渣加甲醇1 ml溶解，作为供试品溶液。

2.2.1.2对照药材溶液的制备 甘草对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。

2.2.1.3阴性对照溶液的制备 按处方配比(甘草除外) 根据制法制成的阴性样品，取阴性样品粉末4.8 g，加甲醇20 ml，照“2．2．1.1”项下方法提取，作为阴性对照溶液。

2.2.2薄层条件与结果 照薄层色谱法(《中国药典》2005年版一部附录Ⅵ B)试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液及阴性对照溶液各4～6 μl ，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(10∶1∶0.5)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干。再重新配置展开剂进行二次展开，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，分别显相同颜色的荧光斑点，阴性对照溶液无干扰。见图2。

2.3人工牛黄的鉴别

2．3．1溶液制备

2.3.1.1供试品溶液的制备 分别取本品8片，除去包衣，研细，加甲醇10 ml，超声处理5 min，滤过，作为供试品溶液。

2.3.1.2对照药材溶液的制备 胆酸、猪去氧胆酸对照品，分别加甲醇制成每1 ml含1 mg的溶液，滤液作为对照品溶液。

2.3.1.3阴性对照溶液的制备 按处方配比(人工牛黄除外) 根据制法制成的阴性样品，取阴性样品粉末2.4 g，加甲醇10 ml，照“2．3．1．1”项下方法提取，作为阴性对照溶液。

2.3.2薄层条件与结果 照薄层色谱法(《中国药典》)2005年版一部附录Ⅵ B)试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液及阴性对照溶液各4～6 μl ，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，以正己烷-醋酸乙酯-醋酸-甲醇(6∶32∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%磷钼酸酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，分别显相同颜色的斑点，阴性对照溶液无干扰。见图3。

3 含量测定

3.1色谱条件 参照《中国药典》[1]2005年版一部有关测定方法，确定检测波长为300 nm。Agilent zorbax 色谱柱C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；乙腈-水(52∶48)为流动相；柱温30 ℃；流速1.0 ml/min，进样量为20 μl。上述色谱条件下，理论板数按欧前胡素峰计算应不低于5000；分离度应大于1.5。

3.2溶液的制备

3.2.1对照品溶液 取欧前胡素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 ml含0.01 mg的溶液，即得。

3.2.2供试品溶液的制备 取本品10片，除去包衣，精密称定，研细，取约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇溶液25 ml，称定重量，超声处理60 min，放冷，再称定重量，用甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

A 对照药材 A 对照药材 A 对照药材

B 供试品584004 B 阴性对照 B 阴性对照

C 供试品783001 C 供试品584004 C 供试品584004

D 供试品788002 D 供试品783001 D 供试品783001

E 供试品889002 E 供试品788002 E 供试品788002

F 阴性对照 F 供试品889002 F 供试品889002

图1连翘TLC色谱图图2甘草TLC色谱图图3人工牛黄TLC色谱图

3.2.3阴性样品溶液的制备 按处方配比，取除白芷外的其他药材，按牛黄化毒片的工艺方法，制得阴性样品，再按供试品溶液的制备方法制成阴性样品溶液。精密吸取对照品、供试品和阴性样品溶液各20 μl，注入液相色谱仪。在与欧前胡素对照品色谱峰相对应的保留时间处，无色谱峰出现，阴性样品溶液无干扰。见图4。

1．欧前胡素

3.3线性关系考察 取欧前胡素对照品，精密称定，加甲醇制成每1 ml含0.100 4 mg的溶液，作为储备液。分别精密量取储备液1、3、5、10和15 ml，置50 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取上述溶液及储备液20 μl，注入液相色谱仪，以浓度(mg/ml)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。得标准曲线方程：Y=4.932 5×104X-4.967 4(r=0.999 9)。结果表明，欧前胡素在0.002 008～0.100 4 mg/ml范围内线性关系良好。

3.4进样精密度试验 取批号为889002的样品1份，按“3.2.2供试品溶液的制备”项下方法操作，按“3.1 ”项下色谱条件分析，精密吸取供试品溶液20 μl，连续进样6次，测定样品中欧前胡素峰面积值，平均峰面积值为466.458 068，RSD为0.53%(n=6)。结果表明，精密度符合要求。

3.5重现性试验 取批号为889002的样品6份，按“3.2.2”项下供试品溶液的制备法操作，按“3.1” 项下色谱条件分析，测定欧前胡素的含量，结果测得样品平均含量为0.072 3 mg/片，RSD为0.63 %，结果表明，重现性符合要求。

3.6稳定性试验 取批号为889002的样品1份，按“3.2.2供试品溶液的制备”项下方法操作，按“3.1” 项下色谱条件分析，分别精密吸取供试品溶液20 μl，分别于0、2、5.5、9、16和24 h进样，测定欧前胡素的含量RSD为0.77%，结果表明，供试品溶液在24 h内测定稳定。

3.7回收率测定 取批号为889002的样品6份，各0.5 g，精密称定，精密加入每1 ml含欧前胡素对照品0.004 823 mg的甲醇溶液25 ml，称定重量，超声处理60 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，作为供回收率测定用的供试品溶液,按“3.1”项下色谱条件分析,计算回收率。结果平均回收率为98.77%，RSD为0.67%。

3．8样品测定 取其他牛黄化毒片样品3批，按“3.2.2”项下供试品溶液的制备方法操作，按“3.1 ”项下色谱条件分析测定，计算3批样品含量，结果见表1。

表1 样品测定(n=2)

4 讨论

4.1检测波长选择 取欧前胡素对照品溶液，在200～400 nm波长处进行扫描，结果表明：欧前胡素对照品在249 nm与300 nm波长处有较大吸收峰。参照《中国药典》2005年版一部“白芷”项下含量测定，以300 nm波长作为含量测定波长。

4.2提取溶剂及提取方法的选择 取批号为889002的样品10片，除去包衣，精密称定，研细，取约1 g，精密称定，以甲醇、乙醚为溶剂，分别采用超声处理、加热回流及索氏提取3种方法进行提取，按“3.1”项下色谱条件分析。结果表明采用甲醇作为溶剂，3种提取方法测定结果基本一致，明显高于以乙醚为溶剂时3种提取方法测定结果。故选取甲醇作为溶剂，超声处理的提取方法。

4.3提取时间的考察 取批号为889002的样品10片，除去包衣，精密称定，研细，取约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 ml，称定重量，分别超声处理30、60、90和120 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液作为供试品溶液。按“3.1”项下色谱条件分析。结果显示4个提取时间测定结果基本一致，为保证提取完全，故采用60 min作为提取时间。

4.4溶剂用量的考察 取批号为889002的样品10片，除去包衣，精密称定，研细，取约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 ml，称定重量，超声处理60 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液作为供试品溶液。按“3.1”项下色谱条件分析。结果显示2个提取溶剂用量含量测定结果无明显差异，故选择25 ml作为牛黄化毒片的提取溶剂用量。

4.5不同色谱柱含量测定的影响 取批号为788002样品溶液，使用Agilent 1100高效液相色谱仪，分别使用Dikma C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱和phenomenex C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm) 色谱柱，按照“3.1”色谱条件分析，测定样品中欧前胡素的含量,结果三种色谱柱测得的含量分别为0.064 6、0.065 6和0.064 4 mg/片。三者含量平均值为0.064 9 mg/片，对测定结果无明显的影响。

4．6其他

中药成分复杂，鉴别仅以单一成分为对照，难以反映药品质量，在尽可能的情况下，应以有效成分和对照药材为对照，并尽量简化操作过程。连翘中有效成分为连翘苷，实验中发现，按《中国药典》2005年一部中连翘药材的方法提取、分离，结果色谱斑点拖尾严重[2]，互相掩盖，难以达到鉴别效果。而本实验可使供试品色谱的分离效果达到最佳，具有较强的专属性。

在甘草中有效成分为甘草酸铵，实验中发现，其内所含成分较为复杂，不易于分离，根据文献[3]试过多种提取方法如正丁醇萃取、乙醚萃取等，但其效果不显著，色谱斑点仍拖尾严重、互相掩盖，不能达到鉴别分离的效果。而本实验可使供试品色谱的分离效果达到最佳，具有较强的专属性。

1 中国药典.一部.2005：4，59，68，117，136

2 王春红.补血胶囊的TLC定性鉴别.湖北中医杂志，2002，24(4)：51

3 韩桂茹，徐韧柳，胡盂魁. 利肺片质量标准研究.中国现代应用药学杂志，2004，21(3)：209