同一GAP产地鱼腥草株间基因多态性研究

刘文龙 ，张喜利 ，贺福元 ，王海琴 ，江星明 ，石继连 ，杨岩涛 ，包小燕 ，陈作红 *

（1.湖南师范大学生科院，湖南 长沙 410081；2.湖南中医药大学药学院，湖南 长沙 410208）

中药植物体为了维持有机体正常生存条件和抵御外界不利环境因素而进行着一系列的代谢活动，其代谢活动分为初生代谢和次生代谢。初生代谢生成了叶绿素、糖类、蛋白质等维持其生存所必需的初生代谢产物；次生代谢是为了应激某种反应或者适应生存环境的某种变化而代谢生成了许多中间体或最终产物，即中药（有效）成分。自然界的生物都是在“遗传”的基础上不断的“变异”以适应周围生存环境。中药的种植生长过程亦是一个遗传变异过程，遗传使得中药的品种不变，变异使得中药成分变化，这是一个自然规律，是任何改变外部因素所不能改变或者是控制的。因此，在传统的质控模式的基础上，应进一步揭示并利用此规律来控制中药材的质量。

鱼腥草为三白草科植物蕺菜Houttuyniae cordata Thunb.的新鲜全草或干燥地上部分。其性辛、微寒,具有清热解毒、消肿排脓、利尿通淋等功能。主要应用于肺痈吐脓、痰热喘咳、热痢、热淋、痈疮肿毒等症[1]。目前,市场上已有以鱼腥草为原料的诸多现代制剂广泛应用于临床，然而因原料的质量差异导致成药质量不稳定，其中鱼腥草注射液因出现免疫毒性而停止生产使用。

近年来，有关利用RAPD或ISSR标记对不同产地鱼腥草种质资源遗传多样性方面的研究已见报道[2-5]，阐明了不同产地鱼腥草存在明显的基因多态性现象，合理解释了道地药材与GAP质控的科学性。而本文以单株鱼腥草为模型中药，联合应用ISSR和RAPD标记对同一GAP产地鱼腥草株间基因多态性展开研究，旨在进一步揭示在完全相同的外部因素（环境因素）下遗传基因多态性规律，为中药的质量稳定性控制提供一种新的思路与方法。

1 实验材料

1.1 材料

鱼腥草采自湖南怀化同一GAP产地，经湖南中医药大学鉴定教研室老师鉴定，采取新鲜完整植株，于－70℃冰箱保存。

1.2 试剂

ISSR引物和RAPD引物由北京擎科新业生物科技有限公司合成，植物DNA快速提取试剂盒和PCR扩增所需试剂均购自北京康为世纪生物科技有限公司。

1.3 仪器

DK-8D电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）；TGL-16G型低温高速离心机（上海安亭科学仪器制造）；LDZX-30KBS立式压力蒸气灭菌器（上海申安医疗器械厂）；CM-230超纯水系统（北京帕思特科技有限公司）；Biophotometer核酸蛋白分析仪 （德国 Eppendorf公司）；5332型 Eppendorf PCR仪 （香港艾本德中国有限公司）；DYY-8C型电泳仪(北京市六一仪器厂)；GZS-1000B型凝胶图像处理系统（上海天能科技有限公司）。

2 实验方法

2.1 DNA提取及检测

采用康为世纪生物科技有限公司的植物DNA快速提取试剂盒提取基因组DNA,并稍加改进。用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测其降解情况,并用Biophotometer核酸蛋白分析仪测定DNA的浓度和纯度。

2.2 引物筛选

选取鱼腥草DNA模板量多、电泳结果清晰的5个模板用于引物筛选，分别为 y6、y17、y26、y39、y43，采用不同产地鱼腥草研究中具有多态性的RAPD[2]和ISSR引物[5]各23条来进行筛选，从中选取扩增稳定、条带清晰的引物作为正式扩增。

2.3 ISSR-PCR分析

ISSR反应体系：总体积25 μL，其中Taq Master Mix （2× ）12.5 μL，Rnase-Free water 9.5 μL，DNA 模板（70 ng/μL）1.0 μL，引物 2.0 μL（10 μM）所有操作均在冰上进行。扩增程序如下：94℃预变性5 min，94℃变性 30 s，52℃退火1 min （不同引物退火温度不同），72℃延伸90 s共35个循环，然后72℃延伸10 min，4℃保存。PCR扩增产物在110 V电压下，1.2%琼脂糖凝胶电泳1 h，电泳结束后在凝胶成像系统中照相并保存。

2.4RAPD-PCR分析

RAPD反应体系：总体积 25 μL，其中 Taq Master Mix（2×）12.5 μL，Rnase-Free water 9.5 μL，DNA 模板（90 ng/μL）1.0 μL，引物 2.0 μL（10 μM）所有操作均在冰上进行。扩增程序如下：94℃预变性 5 min，94 ℃变性 30 s，37 ℃退火 1 min，72 ℃延伸90 s共40个循环,然后72℃延伸10 min，4℃保存。电泳及检测条件同ISSR。

2.5 数据统计与分析

所得到的ISSR和RAPD扩增产物的多态性,根据各分子标记的电泳迁移率及其有无统计所有的二元数据，按DNA记条带的“有”或“无”进行统计，有带（扩增阳性）为“1”，无带（扩增阴性）记为“0”，强带和弱带的赋值均为1，形成0/1矩阵图输入计算机。用NTSYS2pc软件进行数据转换,得到NTS数据表,用similarity项下的qualitative data按SM进行数据计算,所得数据表再在clustering项下按非加权配对算术平均法(UPGMA)进行SAHN聚类分析。

3 结果与分析

3.1 引物筛选结果

通过引物筛选,得出了符合要求的ISSR引物9条,RAPD引物8条作为正式扩增,引物名称、序列和多态位点百分比率见表1。从中可以发现ISSR引物扩增的多态性百分比率普遍高于RAPD引物。

表1 正式扩增的引物名称、序列和多态性比率

3.2 ISSR和RAPD扩增结果

两种分子标记扩增结果见表2，本实验从23条ISSR引物中筛选出的9条引物对供试的46份鱼腥草进行ISSR-PCR扩增。引物 U811的扩增效果见图1，扩增片段大部分集中在300～3 000 bp，共扩增出134条带，其中有115条带呈多态性，多态性条带比率为85.8%，扩增的条带数在12～16之间，平均每条引物扩增出14.9条带。8条RAPD引物对上述同一组供试品扩增后,引物S11的扩增效果见图2，扩增片段大部分集中在500～3 500 bp，共扩增出101条带，其中有72条带呈多态性，多态性条带比率为71.3%，扩增的条带数在5～15之间，平均每条引物扩增出12.6条带。由以上分析可知，两种标记均能有效的揭示出同一GAP产地鱼腥草株间存在较丰富的遗传多样性，但ISSR标记的多态性～条带比率稍高于RAPD标记。

表2 ISSR和RAPD扩增结果

3.3 ISSR和RAPD标记的遗传相似系数分析

采用Nei’遗传相似性系数的计算方法，得到两种标记扩增结果的相似性系数矩阵。按UPGMA方法进行聚类分析，得ISSR和RAPD树状聚类图，从图中可以看出相同生态环境下不同株的46份鱼腥草样品遗传多样性存在较显著差异。

ISSR标记检测同一GAP产地鱼腥草株间的遗传相似性系数范围为 0.543 8～0.903 5，平均为0.678 6，其中2号和3号样品，6号和10号样品的遗传相似系数最高，表明二者亲缘关系最近；43号和44号样品的遗传相似系数最低，表明二者亲缘关系最远。RAPD扩增结果的遗传相似性系数范围在0.567 5～0.891 8，平均为 0.694 7，其中 44号样品的遗传相似系数最低，8号和9号样品的遗传相似系数最高，表明二者亲缘关系最近。

ISSR标记比RAPD标记揭示的遗传相似性系数范围广，而平均遗传相似系数小于RAPD。因此，ISSR标记比RAPD标记更能检测到相同生态环境下不同株鱼腥草间有较显著的遗传差异。

3.4 ISSR和RAPD标记的相关性分析

为了检测同组样品内ISSR和RAPD标记的相关程度,利用Mantel检验对这两种标记的样品遗传相似性系数矩阵进行了相关性分析。检验结果表明，两种标记检测的遗传相似性在供试的46株鱼腥草样品中呈显著的相关（r=0.798 2）。

4 讨论

4.1 同一GAP产地鱼腥草不同株间的基因多样性

ISSR和RAPD标记显示出的聚类结果表明：同一GAP产地的不同株鱼腥草在个体水平上都普遍存在着不同程度的遗传分化，其遗传相似系数均在0.57～0.90之间，说明外界环境只是影响植物基因多态性的其中一个因素，遗传因素才是导致植物个体之间差异的根本原因。

4.2 ISSR和RAPD标记在揭示基因多样性上的比较

两种标记方法在多态性水平及检测水平上有差异。从扩增条带数、多态性条带数、多态性条带比率上看，ISSR标记均稍高于RAPD标记；从遗传相似系数上分析，ISSR标记比RAPD标记的遗传相似性系数范围广，而其平均遗传相似系数小于RAPD。因此，ISSR标记比RAPD标记能反映相对较多的遗传信息，能检测到相同生态环境下不同株鱼腥草间有较高的遗传差异。但同时也看到两种标记的反映的遗传信息是不尽相同的，因此，结合两种方法使用更加全面和客观。

4.3 中药基因多样性与其质量控制

中药材为多成分复杂体系，并具有多效性和整体平衡调节性。中药材质量不稳定是困扰中医药行业进一步发展壮大的瓶颈，是中医药专家学者必须面对并且亟待解决的问题。目前虽然采用指纹图谱[6,7]、生物效应[8]的方法进行质量控制，在一定程度上对中药质量控制有所帮助，但这均不能从本质上解决中药质量的不稳定性。只有充分认识中药的遗传多态性规律，并且运用这一规律，结合以前专家学者的质量控制方法，才能从根本上解决中药质量不稳定现象。

迄今，许多学者已经对此作了一些探讨，如苏文华[9]等通过实验证明，生长在同一生态环境下的短葶飞蓬不同个体之间总黄酮含量最高者高出最低者58.40%。张浩[10]等推测同一环境不同多舌飞蓬之间灯盏乙素含量差异说明其具有遗传背景。本文以同一GAP产地的鱼腥草为模型中药，在之前的研究基础上[11,12]，从更深层次（分子水平）揭示生物基因多态性，进一步揭示中药遗传多态性是造成中药化学成分不稳定的根本原因，从而引起为单株中药质量必定存在一定差异，只有从整体观念出发才能控制中药质量稳定性，因此本课题组将从Hardy-Weinberg平衡群体角度出发，建立相关数学模型，最终获取中药稳态提取工艺中最小投料量，实现中药稳态提取工艺参数化，为保证中药(材)质量稳定性奠定基础。

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