甲状腺激素对大鼠额叶乙酰胆碱的影响

刘俊霞，朱德发，王芬，王取南，马维青

(1.安徽医科大学第三附属医院内分泌科，合肥 230061;2.安徽医科大学第一附属医院老年内分泌科;3.安徽医科大学毒理实验室)

甲状腺功能减退症(甲减)可引起认知功能损伤，包括记忆、注意、执行功能等方面［1］。乙酰胆碱(ACh)是中枢神经系统最重要的神经递质之一，在脑内广泛存在，与学习记忆密切相关。甲减导致乙酰胆碱含量变化的报道甚少，额叶是与学习记忆有关的关键脑区。因此，本研究将26只普通级健康成年期雄性SD大鼠分为甲减组、甲状腺素替代治疗组、健康对照组三组，采用含丙基硫氧嘧啶 (PTU)的自来水诱导建立甲减模型，以乙酰胆碱为指标，采用碱性羟胺比色法测定各组大鼠额叶内乙酰胆碱含量，探讨甲减对额叶内乙酰胆碱的影响及替代治疗效应。

1 材料与方法

1.1 实验动物 普通级健康成年期雄性SD大鼠26只，体质量250～300 g，购自南京实验动物中心。标准实验条件下喂养，自然采光，所有大鼠自由进食、饮水。

1.2 主要仪器及试剂

1.2.1 仪器 T3、T4、TSH采用放射免疫试剂盒(北方生物技术研究所)，检测仪器为DFM-96型16管放射免疫γ计数器;－80℃冰箱;匀浆器;离心机;37℃恒温箱;酶标仪(Biote，美国伯腾仪器有限公司);96孔板。

1.2.2 试剂 PTU、T4(Sigma公司);BCA Protein Assay Kit(Thermo公司);1.5 mmol/L毒扁豆碱(PSS);碱性羟胺(3.5 mol/L NaOH与2 mol/L盐酸羟胺等量混合);1.84 mol/L三氯乙酸;0.37 mol/L FeC13，称 三 氯 化 铁 (AR，FeC13·6H2O)50g，加0.1 mol/L HCl至500m1，过滤后备用;标准贮存液(5 mg/m1):氯化乙酰胆碱62.15 mg或溴化乙酰胆碱77.34 mg(相当于 Ach 50 mg)，加 pH4.0盐酸(0.1 mmol/L)至10 ml，分装安瓶－20℃保存至少可用半年;标准应用液(Ach 0.5 mg/ml):将上液用蒸馏水稀释10倍即得。

1.3 动物模型建立和标本制备 适应性喂养1周后，将大鼠随机分为3组:健康对照组、甲减组、替代治疗组。所有大鼠均喂养6周，对照组大鼠6周均每日饮用自来水;甲减组大鼠每日饮用含0.05%PTU的自来水6周;替代治疗组大鼠每日饮用含0.05%PTU的自来水4周，第5周起开始腹腔注射左旋 T46 μg·kg－1·d－1。每周测体质量 1 次，根据体质量调整给药剂量。实验研究遵循“实验用动物管理和使用指南”。

1.4 标本制备 待测 T3、T4、TSH的血清来源于腹主动脉血，脑标本来源于取血后在冰上迅速分离的脑组织，置于－80℃冰箱保存待测。

1.5 甲状腺素水平测定 血清 T3、T4、TSH水平采用放射免疫法测定。

1.6 碱性羟胺比色法测脑组织内乙酰胆碱含量

1.6.1 乙酰胆碱测定步骤 采用碱性羟胺比色法［2］测定。断头后于冰台迅速取大脑额叶部位组织，用精密电子称重仪称质量，按1∶9(每1克脑组织加9 ml0.9%氯化钠溶液)用玻璃匀浆器制作成脑组织匀浆。(1)取脑组织匀浆0.2 ml加0.35 ml蒸馏水混合，再加 1.5 mmol/L 毒扁豆碱 0.05 ml，缓慢加入1.84 mol/L三氯乙酸0.2 ml充分混合，离心5000 r/min×5 min后取上清进行测定。设定4个管:测定管(A)、标准管(B)、对照管(C)、空白管(D)。(A):取脑组织上清100μl加入测定管，再加入碱性羟胺100μl，于室温置15 min后依次加入4 mol/L HCl和0.37 mol/L三氯化铁各50 ml;(B):标准管中依次加入标准应用液(乙酰胆碱0.5 mg/ml)10 μl、毒扁豆碱 10 μl、双蒸水 55 μl、三氯乙酸(1.84 mol/L)25μl，再加入碱性羟胺100 μl，于室温置15 min后依次加入4 mol/L HCl和0.37 mol/L三氯化铁各50ml;(C):取脑组织上清100μl加入对照管，于室温置15 min后依次加入0.37 mol/L 三氯化铁 50 μl、4 mol/L HCl 50 ml、碱性羟胺100μl;(D):空白管中依次加入毒扁豆碱10 μl、双蒸水65 μl、三氯乙酸(1.84 mol/L)25 μl，于室温置15 min后依次加入0.37 mol/L三氯化铁50 μl、4 mol/L HCl50ml、碱性羟胺 100 μl。以上各管每加入一个试剂均应充分振摇混匀。最后各管取200μl至96孔板中在酶标仪492 nm处比色。(2)BCA法测定脑组织蛋白含量:取脑组织匀浆200μl在4℃离心机15 000 r/15 min离心，取上清按BCA试剂盒说明书操作。

1.6.2 结果计算 (1)按照比色法公式计算:脑组织乙酰胆碱含量(μg/ml)=(A测定管－B对照管)/(C标准管－D空白管)×3.2/0.8×50

(2)每单位脑组织蛋白中所含乙酰胆碱(μg/mg)=比色法公式计算所得脑组织Ach含量(μg/ml)/蛋白含量(mg/ml)

2 结果

2.1 大鼠血清T3、T4、TSH水平 与健康对照组相比，甲减组大鼠血清 T3、T4水平显著减低，TSH水平增高，差异有统计学意义;甲状腺素替代治疗后，血清T3、T4、TSH恢复至正常水平，差异无统计学意义，见表1。

2.2 三组大鼠额叶内乙酰胆碱含量 与健康对照组［(24.40±6.16)μg/mg］相比，甲减组大鼠额叶内乙酰胆碱含量［(17.59 ±2.70)μg/mg］减少，差异有统计学意义(P＜0.05)。替代治疗后Ach含量［(19.34 ±4.42)μg/mg］恢复至正常水平，与健康对照组差异无统计学意义(P＞0.05)。

表1 各组大鼠血清 T3、T4、TSH水平()

表1 各组大鼠血清 T3、T4、TSH水平()

注:与健康对照组比较，a P＜0.05

组别 鼠数(只)T3(nmol/L) T4(nmol/L)TSH(μIU/ml)9 0.83 ±0.09 49.81 ±3.73 1.11 ±0.48甲减组 8 0.60 ±0.09a 18.19 ±5.70a 19.78 ±9.99a T4-6健康对照组9 0.83 ±0.25 52.42 ±6.06 1.21 ±1.01

3 讨论

Ach是记忆、学习功能重要的神经递质［3-4］，由胆碱和乙酰辅酶A为原料在胆碱乙酰移位酶(胆碱乙酰化酶ChAT)的催化下合成，以囊泡形式释放，便被胆碱酯酶(AChE)水解为胆碱和乙酸。基底前脑胆碱能(CBF)神经元(主要位于基底核、斜角带核和内侧隔核)合成大量ACh并经胆碱能投射纤维输送至大脑皮层。胆碱能投射功能的退变直接影响皮层的功能［5］，有人认为原发性痴呆，一个以脑部海马早期损害逐渐延伸全脑的神经退行性疾病，存在严重的胆碱能系统功能退变，ChAT异常表达导致ACh合成障碍，使神经传导缺乏必要的胆碱能递质，从而影响学习和记忆［6］。另有研究发现［7］，以大脑损害为主的血管性痴呆患者也存在认知功能障碍，程度与ACh合成减少和 AChE活性相对增高、ChAT活性降低有关。

本实验研究结果显示，甲减组大鼠额叶内乙酰胆碱含量较健康对照组减少，有研究［8］发现成年期甲减大鼠脑组织内乙酰胆碱含量减少，与我们实验结果一致。胆碱能神经元受损引起的脑组织ACh含量减少，可能是学习、记忆能力下降的重要病理学基础，本实验甲减大鼠Ach含量减少，提示脑内甲状腺激素系统可能通过乙酰胆碱系统发挥对于学习记忆的调节作用。

给予甲减大鼠替代治疗2周，甲减大鼠血清甲状腺激素恢复至正常水平时，额叶内乙酰胆碱含量恢复正常。提示甲状腺激素可以影响胆碱能系统，其具体机制不清，有报道认为甲状腺激素影响Ach的代谢［9］。

本实验提示成年期甲减大鼠额叶内乙酰胆碱含量较健康对照组降低，经替代治疗能使乙酰胆碱含量恢复正常水平，提示甲状腺激素与Ach及胆碱能神经通路有着密切的联系，共同维持胆碱能神经系统的平衡，影响认知功能。

［1］时美琴，杨昊，朱德发，等.原发性甲状腺功能减退症对记忆功能的影响［J］.中国临床保健杂志，2008，11(5):449－450.

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［8］李永军，王群，陆兵勋.成年甲减大鼠认知行为及其机制研究［J］.现代内科学杂志，2008，5(7):577-579.

［9］Smith JW，Evans AT，Costall B，et al.Thyroid hormones，brain function and cognition:a brief review［J］.Neurosci Biobehav Rev，2002，26(1):45-60.