葡萄籽多肽的制备及功能研究

杨碧霞，冯翠萍，张硕，齐海心

（1.山西农业大学 信息学院，山西 太谷 030800;2.山西农业大学 食品科学与工程学院，山西 太谷 030801)

葡萄籽多肽的制备及功能研究

杨碧霞1，冯翠萍2，张硕2，齐海心2

（1.山西农业大学 信息学院，山西 太谷 030800;2.山西农业大学 食品科学与工程学院，山西 太谷 030801)

本试验用风味蛋白酶及碱性蛋白酶，以pH值、酶用量及时间为因素，采用三因素三水平L9（33)正交试验确定葡萄籽多肽制备最佳的酶和酶解条件，结果表明，碱性蛋白酶优于风味蛋白酶，碱性蛋白酶的最佳水解条件是pH值为11.5、酶用量为0.9%、水解时间为18h的条件下达到最大水解度46.16%。葡萄籽多肽有很强的清除DPPH·和H2O2的能力，有一定的清除O－2·和抑制脂质过氧化能力，且总还原力随浓度增加而增加。葡萄籽多肽对金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌1515、黑曲霉和青霉都有较强抑制作用，其抑菌率分别为70.77%、65.28%、59.07%、60.71%、60.71%和50.86%。另外，葡萄籽多肽具有很好的乳化性和乳化稳定性。结果表明该多肽中存在抗氧化肽、抑菌肽、表面活性肽。

葡萄籽;多肽;酶;功能

葡萄是世界普遍栽培的和产量较大的水果之一，在中国有两千年的栽培历史。葡萄的产量很大，据统计，全世界年产葡萄约6500万t，我国年产葡萄约200万t。这些葡萄约80%用于酿酒，13%作为鲜果食用，7%用于加工果汁及其他葡萄产品［1］。葡萄酿酒或进行果汁加工的下脚料主要是葡萄皮与葡萄籽，其中葡萄籽约占鲜果质量的4%～7%［2］，目前国内大多将其免费或廉价出售给农民作饲料或肥料，造成很大浪费。葡萄籽中含有丰富的蛋白质、脂肪、纤维素、矿物质和维生素等营养成分［3～5］。大量科学研究表明，通过选择适当蛋白酶，控制一定水解度，水解葡萄籽蛋白质可得到大量生物活性多肽，这些生物活性肽易被人体消化吸收，且具有许多独特生理功能［6］。如何从葡萄籽中提取多肽活性物质，使之成为功能性食品先导化合物，是葡萄籽多肽物质研究中的一个方向。目前对多肽的研究报道较少，所见文献主要侧重在葡萄籽蛋白的制备上。本试验用酶法制备葡萄籽多肽，并对清除DPPH·、O－2·、H2O2等自由基，抑制体外脂质过氧化，以及其总还原力，抑菌能力和乳化性、稳定性等进行研究，旨在为葡萄籽多肽的开发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料

巨峰葡萄籽：清徐县葡萄酒厂提供。

1.1.2 试验菌株

大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，志贺氏菌，青霉，黑曲霉：山西农业大学食品学院食品安全实验室提供。

1.1.3 主要试剂

风味蛋白酶（酶活力＞3.5万·g－1)，碱性蛋白酶（酶活力10万·g－1)：由南宁恒华道生物科技有限责任公司提供;木瓜蛋白酶：购自北京索莱宝科 技 有 限 公 司;DPPH （1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)、Tris（三羟甲基氨基甲烷)，购自美国Sigma公司;邻苯三酚，硫酸亚铁，硫代巴比妥酸，SDS（十二烷基硫酸钠)，H2O2，铁氰化钾，三氯乙酸，氯化铁，以上试剂均为国产分析纯;大豆色拉油、鸡蛋：市售。

1.1.4 主要仪器与设备

HZQ-C空气振荡器 哈尔滨市东明医疗仪器厂;PHS-3C精密酸度计：上海虹益仪器仪表有限公司;JDG-0.2真空冻干试验机：兰州科近真空冻干技术有限公司;BS224S型电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司;KDN-08消化炉：上海新嘉电子有限公司;凯氏定氮仪：756型紫外分光光度计：上海光谱仪器有限公司;WFJ2100型可见光分光光度计：尤尼柯（上海)仪器有限公司;HZQF160全温振荡培养箱：哈尔滨东联电子技术开发有限公司;YXQ-SG46-280S型不锈钢手提式压力蒸汽灭菌器：上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

1.2 方法

1.2.1 葡萄籽蛋白提取工艺流程

去油后葡萄籽粉→酶法提取（木瓜蛋白酶)［7］→等电点沉淀→离心→真空冷冻干燥→葡萄籽蛋白质

1.2.2 葡萄籽蛋白质含量的测定

葡萄籽粉中蛋白质的测定采用凯氏定氮法，参照GB5009.5-1985《食品中蛋白质含量的测定》。

1.2.3 葡萄籽多肽的制备

1.2.3.1 工艺流程

称料→加水高温蒸煮45min→补水→调节pH→添加酶制剂→升温到85℃灭酶10min→调节pH至中性→Sephadex G-25凝胶纯化→冷冻干燥→多肽

1.2.3.2 酶解制备葡萄籽多肽

在温度恒定的情况下，在每种酶最佳活性范围内选用pH，酶用量，水解时间为试验因素，采用三因素三水平正交试验，根据葡萄籽蛋白质水解度确定最佳水解条件。两种酶因素水平分别见表1、表2。

表1 风味蛋白酶正交试验因素水平表Table 1 The table of factors and levels of flavor protease

表2 碱性蛋白酶正交试验因素水平表Table 2 The table of factors and levels of alkaline protease

1.2.4 功能活性的测定

1.2.4.1 多肽对DPPH·清除作用的测定

清除DPPH·能力测定参照文献［8］方法。

式中，A0：空白吸光度值;A：517nm下加入样品的DPPH的吸光度值;Ab：517nm下不加入样品的DPPH的吸光度值

1.2.4.2 多肽对O－2·清除作用的测定

清除O－2·能力测定参照文献［9］进行。

式中，ΔA1／Δt－邻苯三酚自氧化时的反应速率;ΔA2／Δt－加入样液后邻苯三酚自氧化的速率

1.2.4.3 多肽对 H2O2清除作用的测定

将不同浓度的样液溶解在3.4mL的磷酸缓冲液（pH＝7.4)中，加入0.6mL 40mmol·L－1H2O2，摇匀后，在室温下反应10min，在230nm处检测其吸光度值。

式中，Asample－被测样品的吸光度值;Ablank－空白的吸光度值;Acontrol－不加入样品的吸光度值

1.2.4.4 对体外脂质过氧化抑制作用的测定

体外抗脂质过氧化能力的测定参照文献［10］方法。

式中，Asample－被测样品的吸光度值;Ablank－空白的吸光度值;Acontrol－不加入样品的吸光度值

1.2.4.5 总还原力的测定（TRA)

取1mL试样，pH 6.6的磷酸缓冲液2.5mL和质量分数1%的铁氰化钾溶液2.5mL，混合后在50℃放置20min，加入质量分数10%三氯乙酸2.5mL混合，取混合液2.5mL加入2.5mL蒸馏水和质量分数0.1%的FeCl32.5mL混匀，静置10 min，在700nm处测定吸光度。

1.2.4.6 多肽乳化活性（EA)的测定

取一定体积浓度为0.5%的多肽液，加入同体积的大豆色拉油，以100 000r·min－1的速度高速搅拌1min，之后分别在0min、10min取样，以0.1%（w／v)SDS（十二烷基硫酸钠，pH7.0)稀释100倍，以SDS为空白，500nm处测定吸光度值，以0min的吸光度值（A0)表示乳化活性（EA)，乳化稳定性用ESI表示：

式中，A0－0时刻的吸光值;ΔT－时间差（min);ΔA－ΔT内的吸光值差1.2.4.7 多肽抑菌能力的测定

利用滤纸片法测定抑菌能力。

式中，Dc－处理组的抑菌圈直径（mm);Dw－未处理组的抑菌圈直径

2 结果与分析

2.1 蛋白质含量测定

经凯氏半微量定氮法测定，去油后葡萄籽中蛋白质含量为16.8%。

2.2 最佳水解条件的确定

2.2.1 风味蛋白水解酶酶解结果

由表3可见，风味蛋白酶水解葡萄籽蛋白的最佳条件为 A2B2C3，即pH6.5，酶用量为0.15%，水解时间24h，在此条件下水解度为10.67%。极差值表明各因素对水解度的影响主次为B＞A＞C，即酶用量＞时间＞pH。由表4方差分析结果表明，三种因素对水解度的影响差异都不显著。

表3 风味蛋白酶酶解正交试验结果Table 3 The results of orthogonal experiment of Flavor protease digestion

续表3

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance

2.2.2 碱性蛋白水解酶酶解结果

由表5可见，碱性蛋白酶水解葡萄籽蛋白的最佳条件为 A3B3C2，即pH11.5，酶用量为0.9%，水解时间18h，在此条件下水解度为46.16%。极差值表明各因素对水解度的影响主次为A＞C＞B，即pH＞时间＞酶用量。由表6方差分析结果表明，酶用量对水解度的影响差异极显著，pH、时间对水解度的影响差异显著。

表5 碱性蛋白酶酶解正交试验结果Table 5 The results of orthogonal experiment of Alcalase protease digestion

表6 方差分析Table 6 Analysis of variance

2.3 功能活性的确定

2.3.1 多肽对DPPH·、O－2·和H2O2的清除能力以及对体外脂质过氧化抑制能力和总还原力

由表7可见葡萄籽多肽对DPPH·、O－2·和H2O2的清除能力以及对体外脂质过氧化抑制作用，这四项指标在试验浓度范围，均随着葡萄籽多肽浓度的增加而增大，当其质量浓度达8g·L－1时，清除率及抑制率分别可达到92.83%、93.10%、42.79%、67.09%;其总还原力也随浓度增加而增加。表明葡萄籽多糖具有较强的清除自由基能力及一定的抗脂质过氧化能力，且多肽中可能存在抗氧化肽。

2.3.2 乳化活性（EA)和乳化稳定指数（ESI)

由表8可知，葡萄籽蛋白质较其多肽有较强的乳化活性，而葡萄籽多肽与葡萄籽蛋白相比有较强的乳化稳定性。

表7 葡萄籽多肽对DPPH·、O－2·和H2O2的清除率以及对体外脂质过氧化抑制率和总还原力Table 7 DPPH·、O－2·and H2O2scavenging ability and lipid peroxidation inhibitory activity and total reduction force peptides of grape seed protein and polypeptide（x±SD)

表8 葡萄籽蛋白和多肽乳化活性和乳化稳定指数Table 8 The results of EA and ESI of grape seed protein and polypeptide

2.3.3 葡萄籽多肽抑菌能力

葡萄籽多肽的抑菌能力测定结果见表9。由表9可知，40g·L－1的葡萄籽多肽对金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌1515、黑曲霉和青霉都有较强抑制作用，其抑菌率分别可达70.77%、65.28%、59.07%、60.71%、60.71% 和50.86%，其中对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强。说明多肽中可能含有抑菌肽。

表9 抑菌试验结果Table 9 The antimicrobial activity of grape seed protein and polypeptide

3 讨论

利用蛋白酶水解制备多肽具有安全、快速等优点，且相对于化学方法来说具有副反应少，条件温和等特点，且葡萄籽多肽在碱性蛋白酶的作用下具有较高的水解度。由正交试验结果得出风味蛋白酶在pH值为6.5、酶用量为0.15%、水解时间为24h的条件下达到最大水解度，最大水解度为10.67%，碱性蛋白酶在pH值为11.5、酶用量为0.9%、水解时间为18h的条件下达到最大水解度，最大水解度为46.16%。可见两种蛋白酶对葡萄籽多肽的提取效果碱性蛋白酶优于风味蛋白酶。因此，可用碱性蛋白酶制备葡萄籽多肽。

多肽具有蛋白质的构成和修补机体组织、提供热量、参与体内物质的代谢调节、增强抵抗力、调节渗透压和维持血的酸碱度等特性外，还具有许多特殊的作用。如多肽是传递信息的使者，能对各种各样的生理活动和生化反应进行调节;多肽的生物活性非常高;多肽的分子非常小，相对蛋白质而言，更容易进行人工化学合成［11］。本实验表明葡萄籽多肽有很强的抗氧化能力和还原能力，还具有一定抑菌能力，此外葡萄籽多肽具有很好的乳化性和乳化稳定性，为葡萄籽多肽的开发提供了理论基础。

4 结论

根据两种酶的最佳水解条件进行水解，结果表明，碱性蛋白酶优于风味蛋白酶，碱性蛋白酶的最佳水解条件是pH值为11.5、酶用量为0.9%、水解时间为18h的条件下达到最大水解度46.16%。葡萄籽多肽有很强的清除DPPH·和H2O2的能力，有一定的清除O－2·和抑制脂质过氧化能力，总还原力随浓度增加而增加。此外葡萄籽多肽对金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌1515、黑曲霉和青霉都有较强抑制作用，另外葡萄籽多肽还具有很好的乳化性和乳化稳定性。因此，用碱性蛋白酶可制得水解度较高的葡萄籽多肽，该多肽中存在抗氧化肽、抑菌肽、表面活性肽。

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Preparation of Grape Seed Poly－peptide and Functional Research

YANG Bi-xia1，FENG Cui-ping2，ZHANG Shuo2，QI Hai-xin2
（1.CollegeofInformation，ShanxiAgriculturalUniversity，TaiguShanxi030800;2.CollegeofFoodScienceand Engineering，ShanxiAgriculturalUniversity，TaiguShanxi030801)

In the preparation of grape seed poly－peptide，flavor protease and alkaline protease were used，pH，enzyme dosage and time being the factors，using L9（33)orthogonal test to determine the best of the protease and hydrolysis conditions.The results showed that alkaline protease was superior to flavor protease.If pH was 11.5，the amount of enzyme was 0.9%，hydrolysis time was 18h，alkaline protease could reach the best hydrolysis condition，and the biggest degree of hydrolysis was 46.16%.Grape seed poly－peptide had a strong ability to clear DPPH·and H2O2，a certain ability to clear O－2·and inhibited the lipid peroxidation，the total reducing capacity was increased with the increase of concentration.Besides，grape seed poly－peptide had a strong inhibition effect onStaphylococcusaureus，Shigella，Bacillussubtilis，EscherichiaColi1515，AspergillusnigerandPenicillium，the inhibitory ability for each microbial bacterium was 70.77%，65.28%，59.07%，60.71%，60.71%and 50.86%.Besides，it had good emulsification and emulsion stability.The results also showed this poly－peptide contained antioxidant peptides，anti-microbial peptides and surfactant peptides.

Grape seeds;Poly－peptide;Protease;Biological activity

TQ914.3

A

1671-8151（2011)06-0551-06

2011-09-21

2011-10-25

杨碧霞（1981-)，女（汉)，山西新绛人，硕士，主要从事食品质量与安全方面的研究。

冯翠萍，博士，教授，硕士生导师。Tel：0354- 6288325;E-mail：ndfcp＠163.com。

（编辑：武英耀)