文冠果不定芽再生与快速繁殖

张娜，郭晋平，张芸香

（山西农业大学 林学院，山西 太谷 030801)

文冠果不定芽再生与快速繁殖

张娜，郭晋平，张芸香

（山西农业大学 林学院，山西 太谷 030801)

以成熟文冠果叶片作为外植体，通过器官直接发生途径，对其进行不定芽诱导、不定芽增殖及生根培养，建立了一种简单易行的、可再生的文冠果快速繁殖方法。结果表明，在不定芽诱导阶段，当MS培养基添加2.0mg·L－1BA和0.2mg·L－1NAA时，不定芽诱导率最高;高浓度的BA显著降低不定芽诱导率;当MS培养基添加2.0mg·L－1BA和0.1mg·L－1NAA，每个外植体获得的不定芽数达到最大;当叶片远轴面接触培养基时，不定芽诱导率高于近轴面接触培养基。在增殖培养阶段，当MS培养基添加0.5mg·L－1BA时，不定芽增殖率、增殖个数及增殖芽长均达到最大;在不同浓度的BA培养基中添加NAA降低了不定芽的增殖效果。在生根培养阶段，1／2MS培养基添加0.5mg·L－1IBA的生根率最高;IBA的生根效果显著优于NAA或IAA。生根苗在含有土壤、沙子和泥炭的混合基质（1∶1∶1)中移栽成活。

文冠果;叶片外植体;器官直接发生;增殖;生根

文冠果 （XanthocerassorbifoliaBunge.)隶属无患子科文冠果属，是我国特有的珍稀木本油料树种，广泛分布于北方地区［1］。其种子含油率达30%～60%，种仁含油率高达55%～66%，被誉为“北方油茶”［2］。在石油资源日益枯竭的今天，文冠果作为重要的生物质能源树种，因其耐干旱、耐瘠薄、适应性广的特性，无疑具有更大的发展前景。

优良的文冠果品种需要通过无性繁殖的方式进行繁殖，以保持其优良性状。然而，文冠果枝条扦插生根率低，虽然根插生根率较高［3］，但取材不方便，且容易破坏植株根系;而嫁接耗时长，且成活率也较低［4］。因此，组织培养技术成为大规模、快速繁殖优良文冠果的必然选择。

文冠果属于组织培养繁殖困难树种，其组织培养体系仍处于初期阶段。目前已有学者对文冠果的部分器官进行组织培养，如张桂琴［5］、王永明［6］、王玉珍［7］、柳金凤［8］及兰士波［9］分别采用文冠果茎段作为外植体进行培养;黄永伟等［10］对影响文冠果生根的因素进行研究;顾玉红［11］、臧国忠［12］及李晶等［13］以文冠果成熟或未成熟种胚作为外植体进行体细胞胚诱导。

本研究以成熟文冠果叶片作为外植体，通过器官直接再生途径对不定芽进行诱导，并对不定芽的增殖及生根等环节进行系统研究，旨在为快速、大规模繁殖优良文冠果提供理论依据与技术支持，同时也为建立文冠果遗传转化体系奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料与准备工作

自山西农业大学林学院苗圃栽培的七年生文冠果‘文冠一号’中挑选健康、无病虫害的嫩叶作为外植体，在超净工作台上，先采用75%的乙醇处理30s，无菌蒸馏水冲洗三次，再用0.1%升汞消毒4 min，无菌蒸馏水冲洗五次，之后去掉叶片边缘，准备接种，如无特殊说明，所有接种叶片均以远轴面接触培养基。

1.2 试验方法

1.2.1 不同浓度的BA与NAA对文冠果不定芽诱导的影响

将消毒后的叶片外植体接种于MS基本培养基，并添加不同浓度（1.0，2.0，3.0mg·L－1)的BA 与NAA （0.1，0.2，0.5mg·L－1)进行完全随机组合，共九个组合 （详见表1)，观察不同浓度的BA与NAA对文冠果不定芽诱导的影响。本阶段采用培养皿作为接种容器，每个培养皿中接种20个叶片，每个组合接种三个培养皿，重复三次，30 d后统计不定芽诱导率及每个叶片外植体诱导的不定芽数，筛选出最佳文冠果不定芽诱导培养基。

1.2.2 叶片外植体的不同放置方向对文冠果不定芽诱导的影响

将上述筛选出的最佳文冠果不定芽诱导培养基作为基本培养基，将消毒后的叶片外植体分别以远轴面或近轴面接种于培养基中，观察叶片外植体的不同放置方向对文冠果不定芽诱导的影响。接种器皿、试验重复及数据统计同上。

1.2.3 不同浓度的BA及其与NAA组合对文冠果不定芽增殖的影响

将诱导获得的不定芽转接于MS基本培养基，并添 加 不 同 浓 度 （0.1，0.2，0.5，1.0 ，2.0 mg·L－1)的BA或分别与0.1mg·L－1NAA组合 （详见表2)，观察不同浓度的BA及其与NAA组合对文冠果不定芽增殖的影响。此阶段的不定芽培养于锥形瓶中，每次接种30个不定芽，重复三次，30d后统计文冠果不定芽的增殖率、每个不定芽的增殖个数及增殖芽长。

1.2.4 不同种类及不同浓度的生长素对文冠果试管苗生根的影响及移栽

将增殖获得的、生长健壮的不定芽转接于1／2 MS基本培养基，未添加任何生长素的作为对照，或分别添加不同浓度 （0.2，0.5，1.0，2.0，5.0 mg·L－1)的NAA、IBA及IAA（详见表3)，研究不同种类及不同浓度的生长素对文冠果试管苗生根的影响。此阶段的不定芽培养于锥形瓶中，每次接种30个不定芽，重复三次，30d后统计生根率、生根条数及根长。

选取60个生长健壮的生根苗，进行移栽培养。首先将其放置于生长室进行炼苗，两周后从锥形瓶中取出生根苗，洗净根部的培养基，然后移栽到含有土壤、沙子和泥炭的混合基质 （1∶1∶1)中，在温室条件下生长。30d后统计移栽成活率。

以上培养基中均添加蔗糖3%，琼脂0.45%，pH调至5.8～5.9，121℃高压灭菌15min。所有培养物均培养于（25±2)℃的恒温培养箱中。

1.3 数据统计

将所有数据采用SPSS统计软件进行单因素方差分析，并在0.05水平上采用Duncan多重比较方法进行显著性检验。

2 结果与分析

2.1 不同浓度的BA与NAA对文冠果不定芽诱导的影响

在所有诱导培养基中均观察到，叶片外植体的伤口处或叶脉处直接诱导出不定芽 （图1a)，且没有愈伤组织发生。研究结果表明，不同浓度的BA和NAA对不定芽诱导率及每个外植体产生的不定芽数均有显著影响 （见表1)。

表1 不同浓度的BA与NAA对文冠果不定芽诱导的影响Table 1 Effect of different concentrations of BA and NAA on adventitious shoot induction of Xanthocerassorbifolia

当 MS培养基添加2.0mg·L－1BA 和0.2 mg·L－1NAA 时，不定芽诱导率最高，高达96.7%。高浓度的BA显著降低不定芽诱导率。而当 MS培养基添加2.0mg·L－1BA以及0.1 mg·L－1NAA时，每个外植体产生的不定芽数最多，达10.6。BA浓度高于或低于2.0mg·L－1都显著降低了每个外植体产生的不定芽数。

无论BA的浓度高低，当NAA的浓度为0.1 mg·L－1或0.2mg·L－1时，不定芽诱导率无显著差异;当NAA的浓度为0.5mg·L－1时，不定芽诱导率则显著降低。而当NAA的浓度为0.1 mg·L－1，每个外植体产生的不定芽数显著高于0.2mg·L－1或0.5mg·L－1。

2.2 叶片外植体的放置方向对文冠果不定芽诱导的影响

当外植体的远轴面接触培养基时，不定芽诱导率显著高于近轴面接触培养基 （95.3%vs 80.7%)，而每个外植体产生的不定芽数并未显著差异 （8.9vs 8.6)。

2.3 不同浓度的BA及其与NAA组合对文冠果不定芽增殖的影响

将诱导获得的不定芽转接于仅含BA或BA与0.1mg·L－1NAA组合的培养基中进行增殖培养。方差分析表明，不同浓度的BA或BA与NAA组合对不定芽的增殖率、增殖芽数及芽长均有显著性影响 （见表2)。

表2 不同浓度的BA及其与NAA组合对文冠果不定芽增殖的影响Table 2 Effect of different concentrations of BA alone or with NAA on adventitious shoot proliferation of X.sorbifolia

在仅含有BA的培养基中，增殖率随着BA浓度的升高而升高，当BA浓度达到0.5mg·L－1时，增殖率达到最大 （图1b)，高达92.2%，之后随着BA浓度的继续升高呈下降趋势。增殖芽数及芽长与增殖率表现出相同的趋势。

在BA和NAA的组合中，当培养基中添加0.5mg·L－1BA和0.1mg·L－1NAA 时，增殖率最高，可达到90.6%。当BA浓度高于或低于0.5mg·L－1时，增殖率都呈下降趋势。增殖芽数与增殖率亦呈相同趋势，而芽长并无显著差别。

无论培养基中仅含有BA或BA与NAA组合，当BA浓度为1.0mg·L－1时，有玻璃化苗发生，且这种现象随BA浓度的升高而加剧 （图1 c)。另外，在培养四周后，应及时将增殖苗转接到新鲜的增殖培养基中，否则增殖苗就会枯死。

2.4 不同种类及不同浓度的生长素对文冠果试管苗生根的影响及移栽

在未含任何生长素的1／2MS培养基中，试管苗逐渐变褐或枯萎。因此，有必要在1／2MS培养基中添加不同类型的生长素对其进行生根诱导。结果表明，不同种类及不同浓度的生长素对生根率、生根条数及根长均有显著影响 （见表3)。

表3 不同种类及不同浓度的生长素对文冠果试管苗生根的影响Table 3 Effect of different concentrations and types of auxins on rooting of in vitro regenerated shoots of X.sorbifolia

在所有的生根培养基中，当添加0.5mg·L－1IBA时，生根率最高，达51.1%，生根效果最好（图1d);其次是添加0.2mg·L－1IBA。当IBA浓度高于0.5mg·L－1时，生根率显著下降。而当培养基中添加2.0mg·L－1IBA时，诱导的生根条数及根长最大。然而，试验中发现，当IBA浓度高于1.0mg·L－1（含1.0mg·L－1)时，试管苗基部会产生愈伤组织，且诱导的根呈膨松状 （图1e)。

在添加NAA的培养基中，当NAA浓度为1.0mg·L－1时，诱导的生 根率最高，仅达13.33%。而当 NAA浓度为2.0mg·L－1时，诱导的根数及根长达到最大。高浓度的NAA也促使试管苗基部产生愈伤组织，当其浓度高达5.0 mg·L－1时，试管苗基部诱导的愈伤组织会产生大量气生根。

在添加IAA的培养基中，仅当IAA浓度为1.0或2.0mg·L－1时，可诱导产生根，最高生根率仅达7.78%。当IAA浓度为1.0mg·L－1时，其生根条数高于2.0mg·L－1诱导的生根条数;而当IAA浓度为2.0mg·L－1时，其根长长于1.0 mg·L－1时诱导的根长。

在温室条件下，移栽成活率为56%，且生长表现正常 （图1f)。

图1 文冠果叶片外植体通过器官直接发生途径诱导不定芽再生与快速繁殖Fig.1 Plant regeneration via direct organogenesis from leaf explants and micropropagation of Xanthocerassorbifolia.

3 结论与讨论

在植物组织培养中，细胞分类素和生长素结合使用有利于不定芽的诱导。所有的生长素和细胞分裂素中，BA和NAA是诱导不定芽最普遍的植物生长调节剂［14］。不同浓度的BA和NAA对不定芽的诱导率有所不同。本研究发现，当培养基中添加2.0mg·L－1BA 和0.2mg·L－1NAA时，不定芽诱导率最高。Xu et al.［15］在岩桐的再生体系中报道了相似的结论。而高浓度的BA显著降低了不定芽诱导率。

与不定芽诱导率相似，随着NAA浓度升高，每个外植体产生的不定芽数也呈下降趋势。研究结果表明，在培养基中添加2.0mg·L－1BA和0.1mg·L－1NAA 时，诱导的不定芽数最大。Ghimire et al.［14］采用相同的激素组合用于诱导多芽水蓝青，得出类似结论。我们的研究结果进一步证实了Skoog and Miller［16］的报道，该研究表明，在试管苗器官发生中，外源生长素与细胞分裂素组合是必需的，而低浓度的生长素和细胞分裂素是不定芽分化的先决条件。

低浓度BA和NAA组合已成功应用到其他树种的不定芽增殖培养［17］。然而，本研究结果表明，相对于单独使用BA的增殖效果而言，NAA并未提高不定芽增殖率。可能是由于细胞分裂素生物合成失调，促使其新陈代谢失活所致［18］。当培养基中添加0.5mg·L－1BA时，诱导的增殖芽数及增殖芽长最大。随着BA浓度升高，其显著下降。此结果与Tilkat and Onay［19］对阿月浑子的研究结果不一致，该研究表明，高浓度BA诱导的不定芽数更多，芽更长。可能是不同树种需要不同的植物生长调节剂浓度来调控内源激素与外源激素的平衡，从而促进不定芽增殖。

此外，当不定芽培养于添加1.0mg·L－1BA或1.0mg·L－1BA和0.1mg·L－1NAA的增殖培养基时，发现少量的玻璃化苗，而且这种现象随着BA浓度的升高而加剧。其主要原因是高浓度的 BA 导致［20］。

IBA是一种广泛用于组培生根困难树种的生长素［21］。本研究表明，1／2MS培养基添加0.5 mg·L－1IBA时，生根率最高。当IBA浓度过高时，试管苗基部会产生愈伤组织，并诱导出部分根，且根呈膨胀状。Gupta and Mahalaxmi［22］在黑莓的生根诱导中也发现了类似现象。可能是由于IBA浓度过高导致。另外，本研究发现，NAA的生根效果没有IBA生根效果好。然而，也有一些研究表明NAA的生根效果更佳，如蓖麻［23］和柑橘［24］。不同物种可能需要不同种类的生长素来诱导生根。

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Shoot Regeneration and Micropropagation ofXanthocerassorbifoliaBunge.，a Potential Bioenergy Tree

ZHANG Na，GUO Jin-ping，ZHANG Yun-xiang
（CollegeofForestry，ShanxiAgriculturalUniversity，TaiguShanxi030801，China)

An efficient and reproducible protocol was developed to induce direct organogenesis from leaf explants ofXanthocerassorbifoliaBunge.，apotential bioenergy tree.The highest frequency of shoot induction was observed on Murashige and Skoog（MS)medium supplemented with 2.0mg·L－16-benzylaminopurine（BA)and 0.2mg·L－1naphthaleneacetic acid（NAA)at a rate of 96.7%.Higher concentrations of BA resulted in significant decrease of shoot induction frequency.The greatest number of shoots per explant was obtained on medium containing 2.0mg·L－1BA and 0.1mg·L－1NAA.When in contact with the medium，the abaxial surface of leaf explants was better than the adaxial surface in shoot induction frequency.The highest shoot multiplication rate，number of proliferated shoots and shoot length were observed on MS medium containing 0.5mg·L－1BA.Addition of NAA to the medium with different concentrations of BA decreased the multiplication efficiency.The highest frequency of rooting（51.1%)was obtained on half-strength MS medium （1／2MS)combined with 0.5mg·L－1indole-3-butyric acid（IBA).The efficiency of rooting on medium supplemented with IBA was significantly higher than that on medium with NAA or indole-3-acetic acid（IAA).Rooted plantlets were acclimatized in pots containing 1∶1∶1mixture of soil，sand and peat.

Xanthocerassorbifolia;Leaf explant;Organogenesis;Proliferation;Rooting

S722.8＋9

A

1671-8151（2011)06-0492-06

2011-10-14

2011-11-07

张娜（1985-)，女（汉)，山西新绛人，在读博士生，主要从事森林培育方面的研究。

郭晋平，教授，博士生导师。Tel：0354- 6286909;E-mail：jinpguo＠126.com

山西省林业厅科技创新项目（2010001);山西省研究生优秀创新项目（20093061)

（编辑：武英耀)