用于纯化大黄素的分子印迹聚合物的制备与性能测试

陈立勇，骆玉涵，李红霞

(河北联合大学化工与生物技术学院，河北唐山 063009)

分子印迹技术是近年来兴起的一种新型分离技术。利用分子印迹技术制备的聚合物(MIPs)对特定物质分子具有特定的选择性，能够在高温、高压、有机溶剂、酸、碱等环境条件下使用，并且造价低廉，因此在固相萃取［1］、化学反应、膜分离［2］、色谱分离［3］、模拟酶、仿生传感器［4］等领域得到了普遍应用，展现出良好的发展前景。

大黄素是一种广谱抗菌药物，生理活性广泛，医用价值很高［5］，具有抗肿瘤、降血脂、镇痛消炎、提高免疫力等多方面作用，是大黄中的主要活性成分。传统提取大黄素步骤复杂，纯品大黄素价格昂贵，而1，8－二羟基蒽醌价格较低，结构和大黄素相似，结构式如图1。

图1 大黄素和1，8－二羟基蒽醌结构式

因此选择1，8－二羟基蒽醌为模板分子制备分子印迹聚合物，并测试其对大黄素的吸附性能和选择识别能力。

1 实验部分

1.1 主要仪器和药品

UV-1100紫外分光光度计(上海天美科学仪器有限公司);H66025T超声清洗机，无锡超声电子设备厂。

大黄素标准品，纯度99%，购买于陕西省西安天园生物制剂厂;偶氮二异丁腈为化学纯;1，8－二羟基蒽醌，丙烯酰胺，乙二醇二甲基丙烯酸酯等均为分析纯。

1.2 聚合物的制备

称取270mg 1，8－二羟基蒽醌模板分子，充分溶解于8mL的丙酮中，加入288mg AM功能单体，3.96gEDMA交联剂和65mg AIBN引发剂，超声处理10min，然后将溶液倒入试管中，密封，通氩气脱氧15min，将密封好的试管放入60℃的水浴中恒温聚合24h。聚合完全后，得坚固的棒状固体聚合物。将聚合物研磨，过200目筛后放入索式提取器中，用体积比为8:2的甲醇乙酸混合溶液洗脱，直至洗脱液在435nm下无模板分子检出为止，再用丙酮洗去残留的乙酸，60℃干燥24h，得到印迹聚合物。空白聚合物的制备除不加模板分子外，其它步骤均相同。

1.3 平衡结合试验

称取25mg印迹聚合物，置于l0mL的具塞比色管中，加入5mL浓度为0.5mmol/L的大黄素的丙酮溶液，将其在恒温水浴振荡器上室温振荡24h，然后将此混合液以3000r/min的转速离心5min，取上清液，测量大黄素的平衡浓度。根据吸附前后溶液中大黄素浓度的变化，计算聚合物对底物大黄素的吸附量Q，由Scartchard分析计算得出饱和吸附量Qmax。依下式计算吸附量:

1.4 吸附等温线的测定

称取8 份产品，每份25mg，分别置于8 支10mL 具塞比色管中，加入5mL 浓度依次为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0mmol/L 的大黄素的丙酮溶液，摇匀后密封，常温振荡 24 小时，将此混合液以 3000r/min 的转速离心5min，取上清液0.2mL于10mL容量瓶中，用丙酮定容。在波长435nm处，测定聚合物对不同浓度大黄素溶液的吸附量，并绘制吸附等温线。

2 结果与讨论

2.1 聚合条件的选择

2.1.1 交联剂和制孔剂的选择

交联剂的分子链既要有一定的柔性，使产生的孔穴有可近性，能快速达到结合平衡，另一方面为保证孔穴具有足够的稳定性又要求分子链不能太柔。目前，常用的交联剂有乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)和三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRIM)。本研究选择价格便宜的EDMA作为交联剂，经实验确定模板分子与交联剂的比例为l:20(mol/mol)。模板分子与功能单体的作用受溶剂影响较大。极性溶剂不利于模板分子和功能单体形成复合物，所以要选择极性小，对氢键影响弱的惰性有机溶剂。氯仿对本实验的模板分子溶解性差，乙腈和四氢呋喃价格高且具有较大的毒性，丙酮作为溶剂具有较好的效果，经实验确定丙酮的最佳用量为8ml。

2.1.2 聚合温度的选择

自由基热引发方式制备分子印迹聚合物的温度影响着聚合效果，当聚温度低于55℃时，聚合过程缓慢，12小时后仍然只有较小的悬浮颗粒，24小时后聚合物颗粒呈松软的蛋糕状;聚合温度为60℃时，2小时后开始出现白色聚合物沉淀，约12小时后聚合物基本形成，24小时后形成坚硬的聚合物。温度为65℃时，溶液在30min内有颗粒出现，约1小时后发生爆聚，反应失败，由于引发剂在高温下分解速率过快，反应难于控制。因此，选择聚合温度为60℃。

2.1.3 功能单体的选择

功能单体应该具有与模板分子发生作用的功能基团，选择的依据是模板的性质以及单体与模板分子作用力的大小。常用的功能单体是甲基丙烯酸和丙烯酰胺。本实验中的模板分子1，8－二羟基蒽醌为弱酸性，因此选择弱碱性的丙烯酰胺作为功能单体，以保证形成稳定的复合物。在非共价分子印迹中，功能单体和模板分子处于动态平衡，加入过量的功能单体有利于复合物的形成。但单体过多会使MIPs中的非选择性位点增加，造成MIPs选择性下降。选择单体与模板的比例为3:1、4:1和5:1进行实验，得到的聚合物分别为P1、P2、P3，对应的非分子印迹聚合物为NP1、NP2、NP3。采用静态平衡法测定聚合物对不同浓度大黄素的吸附等温线，见图2。

图2 分子印迹聚合物的吸附等温线

由图可知单体与模板的比例为4:1时，吸附性能最好，故选择功能单体与模板分子的比例为4:1。空白聚合物吸附能力明显低于印迹聚合物。

2.2 印迹聚合物的吸附性能测试结果

聚合物P1、P2、P3对大黄素的吸附性能测试结果如见表2，P2的效果最佳。

表2 聚合物对大黄素的吸附量

2.3 印迹聚合物对大黄素的结合性能测试

Scatchard分析主要是研究物质之间的专一性作用的，以非特异性的物理吸附为主的非分子印迹聚合物不能用该模型来模拟说明聚合物颗粒与底物分子的吸附作用类型。根据Scatchard分析原理，样品NP1、P1、P2、P3的Scatchard分析曲线如图3～6，NP2、NP3的Scatchard分析曲线与NP1相似。

图3 NP1的Scatchard分析曲线

图4 P1的Scatchard分析曲线

图5 P2的Scatchard分析曲线

图6 P3的Scatchard分析曲线

由上图可见:

(1)非分子印迹聚合物NPl关系点分布紊乱，线性回归系数低，不能按Scatchard分析方法中的意义求出相应的最大表观结合位点数Qmax和离解常数Kd。

(2)作分子印迹聚合物P1、P2、P3的Scatchard曲线，并进行线性回归，可得到一条线性良好的直线，回归方程和相关系数可从图中读出。说明上述聚合物对相应的模板分子呈现良好的亲和力，即存在等价的同类结合位点，证明聚合物对底物的识别是在空腔中进行的。

(3)由Scatchard曲线的斜率和截距可求得各聚合物的最大位点结合数、离解常数。具体结果见表3。

表3 分子印迹聚合物的结合性能参数

从聚合物的最大位点结合数和分配系数可知，聚合物对大黄素有高的、均一的结合作用。制备的聚合物对大黄素分子具有类似的结合位点，这种结合具有较好的选择性。从相关系数比较来看，功能单体为丙烯酰胺，模板分子与功能单体比例为1:4时，合成的聚合物的性能较好。

3 结论

(1)优化了采用本体聚合方法合成分子印迹聚合物的条件。以丙烯酰胺为功能单体，模板分子与功能单体比例为1:4，8mL丙酮为致孔剂，合成的聚合物对大黄素的吸附性能较好，且识别选择性最强。

(2)聚合物对大黄素的吸附量较高，说明聚合物对大黄素具有较好的选择识别能力。

［1］李礼，胡树国，何锡文等.应用分子印迹－固相萃取法提取中药活性成分非瑟酮［J］.高等学校化学学报，2006，27(4):608-611.

［2］Wnag H Y，Kobayashi T，Fujii N.Moleculra imprint membranes of polyacrylonitrile copolymer with different acrylic acid segments［J］.Langm uir，1996，12:4850-4856.

［3］Zander A，Findlay P，Renner T，et a1.Anlsysis of nicotine and its oxidation products in nicoitne chewing gum by a molecluarly imprinted solid-phase extraction［J］.Ana1.Chem，1998，70(15):3304-3314.

［4］武五爱，尹志芬，尉景瑞等.米托蒽醌分子印迹传感器的研究及其应用［J］.高等学校化学学报，2008，29(7):1334-1338.

［5］卢艳花主编.中药有效成分提取分离技术［M］.北京:化学工业出版社，2004.