醋柳黄酮对高血压大鼠主动脉环舒缩反应的影响及机制

高天林,余 琴,刘应才,蒋 毅,谢雪梅

(泸州医学院附属医院心内科,四川泸州646000)

醋柳黄酮(total flavones of hippophae rhamnoides L,TFH)是一种从野生胡颓子科植物醋柳(俗称沙棘)的果实中提取出的一种有效成分。TFH含有7种单体成分,其中以槲皮素(quercetin,Que)及异鼠李素(isorhamnetin,Iso)含量较高。TFH具有重要的心血管保护作用,包括抗氧化、扩血管、降压、抗凝、抑制心肌肥厚和保护内皮功能等[1]。血管内皮细胞可合成和分泌一氧化氮(NO),NO具有强有力的扩张血管、降低血压、抑制血小板黏附和聚集等作用,是已知的具有抗高血压作用的保护性因子。本实验用TFH灌胃治疗腹主动脉缩窄高血压大鼠6周,观察大鼠离体主动脉环对血管活性药物的舒缩反应,并检测血清NO浓度的变化,旨在探讨醋柳黄酮?的舒张血管作用及其机制和NO的关系,为选择黄酮类药物在高血压防治中的应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 药品与仪器 TFH(商品名:心达康片)购自四川美大康药业股份有限公司(国药准字 Z51020089,批号 100101),卡托普利(CP)购自汕头金石制药总厂(国药准字H44024904,批号100403),乙酰胆碱(Ach)、Krebs液所用试剂均购自Sigma公司,左旋硝基精氨酸甲酯(L-NANE)购自碧云天生物技术研究所,重酒石酸去甲肾上腺素(NE)购自武汉远大制药集团有限公司(国药准字 H42021301,批号 090201),一氧化氮试剂盒购自南京建成生物工程研究所,Krebs溶液成分为NaCl 127 mmol/L,KCl 5.9 mmol/L,MgCl21.2 mmol/L,NaH2PO40.25 mmol/L,CaCl22.4 mmol/L,HEPES 10.0 mmol/L,Glucose 12.0 mmol/L,pH为7.4,实验时临时配制。Powerlab生理实验系统,规格型号Powe-lab/8sp,购自澳大利亚 Powerlab公司,M LT0202高灵敏张力传感器,购自AD Instruments公司,HSS-1型恒温浴槽,购自成都仪器厂。

1.2 动物模型的制备 取健康Wistar大鼠55只,雄性,体质量180～200 g,由泸州医学院动物中心提供。随机分为腹主动脉缩窄手术组45只和假手术组10只。参照文献并对手术方式加以改进,用1%巴比妥钠0.5 mL/100 g腹腔注射麻醉后,于左肋弓下缘0.5 cm、脊柱前0.5 cm处行 1.5～2.0 cm纵切口,逐层分离皮下组织,在左右肾动脉分支之间的腹主动脉下方穿入2.0手术缝线,沿血管走行方向放置针尖磨钝的7号注射针头,与腹主动脉一起结扎后小心拔出针头,腹腔滴入青霉素(40万U/mL)适量,逐层关腹,缝合。术后腹腔注射青霉素10万U/mL,连续3 d。假手术组不结扎腹主动脉,其余同手术组。术后正常饮食,定时观察体征。建模7 d后(45只),腹主动脉缩窄手术组随机抽取5只采用颈动脉插管术,利用Powerlab测量颈动脉血压,血压均大于150 mm Hg,建模成功。

1.3 实验动物分组 腹主动脉缩窄手术组剩余40只随机分为 4组,每组10只;即模型组、TFH 组、CP 组、TFH+CP组。假手术组、模型组每日用饮用水 10 mL/kg灌胃。TFH组用TFH 30 mg/kg;CP组用CP 100 mg/kg;TFH+CP组用 TFH 20 mg/kg和CP 60 mg/kg,将上述药物溶解于饮用水中,按10 mL/kg每日1次胃管灌入,共6周。

1.4 方法

1.4.1 血浆NO的检测 大鼠麻醉后,剪开胸部,心脏采静脉血6 mL,高速离心后分离出血清,-20℃保存待用。应用硝酸还原酶法,采用南京建成生物研究所提供的NO检测试剂盒,严格按照说明书要求操作。

1.4.2 血管环制备及灌流 采血完毕,迅速剪下右肾动脉以上的胸主动脉,置于通以混合气体(95%O2+5%CO2)的Krebs溶液中,小心去除周围结缔组织后将血管剪成4～5 mm宽的血管环。血管环插入两根直径200 μ m银丝做成的等腰三角形支架,其底边与血管环等长,其顶角穿入丝线结扎,移入10 mL盛有Krebs液的37℃恒温浴槽,浴槽中持续充入混合气体。丝线一端固定于浴槽底部,一端连于张力传感器,传感器与放大装置相连,然后将信息输入电脑。操作过程中避免过度牵拉,以保护内皮的完整。用NE 10-6mol/L检测离体胸主动脉环的活性,选择经NE 10-6mol/L处理后收缩的离体胸主动脉环,静息负荷为2 g,平衡90 min,平衡期间每30 min更换Krebs液1次。

1.4.3 实验方法 每次实验前,均预先用40 mmol/L KCl孵育最大收缩达平台后,用Krebs液进行洗脱6次。观察各组血管环:在次最大收缩剂量(10-5mol/L)的NE预收缩最大张力达平台后,检测对Ach(3×10-7～3×10-4mol/L)累积浓度的内皮依赖性舒张作用,以NE 10-5mol/L预收缩最大收缩幅度为100%,加入不同浓度Ach后的血管张力幅度与NE诱发最大收缩幅度之间的百分比反映内皮依赖性舒张的变化;LNAM E(10-4mol/L)孵育 30 min后,再用 NE 10-5mol/L预收缩血管达稳态后,检测对 Ach(3×10-7～3×10-4mol/L)累积浓度的内皮依赖性舒张作用的影响;分别测定不同浓度NE(10-7～10-4mol/L)时血管的收缩改变,诱导动脉环收缩反应的程度表示为40 mmol/L KCl最大收缩反应的百分比。

2 结 果

2.1 对大鼠血清NO浓度的影响 各组分别灌胃饲养6周后,模型组血清NO的浓度显著低于假手术组(P＜0.05)。三组用药组(TFH 组、CP组、TFH+CP组)与模型组比较,血清NO的浓度均显著升高,差异有统计学意义(P＜0.05)。TFH组、CP组与假手术组比较差异无统计学意义(P＞0.05),TFH+CP组与假手术组比较血清NO浓度显著升高,差异有统计学意义(P＜0.05)。三组用药组之间比较,TFH组较CP组血清NO浓度显著升高,差异有统计学意义(P＜0.05),与TFH+CP组比较差异无统计学意义(P＞0.05);TFH+CP组与CP组比较血清 NO浓度显著升高(P＜0.01),见表1。

表1 各组大鼠血清NO浓度比较(±s,n=10)

表1 各组大鼠血清NO浓度比较(±s,n=10)

a:P＜0.05,与模型组比较;b:P＞0.05,c:P＜0.05,与假手术组比较;d:P＜0.05,e:P＞0.05,与TFH 组比较;f:P＜0.01,与CP组比较。

组别 NO(μ mol/L)假手术组 43.06±10.36a模型组 15.28±9.25 T FH 组 62.50±28.47ab CP组 37.78±10.42abd T FH+CP组 71.76±20.22acef

2.2 对胸主动脉舒张功能的影响 NE预收缩后,大鼠胸主动脉对低、高浓度的Ach诱发的舒张反应,模型组与假手术组比较显示舒张率显著下降(P＜0.05),最大舒张百分率较假手术组显著下降[(35.08±21.59)%∶(63.04±8.63)%,P＜0.01]。TFH组、CP组、TFH+CP组均能不同程度改善高血压大鼠胸主动脉对低、高浓度的Ach诱发的舒张反应,与模型组比较舒张率有显著升高(P＜0.05)[最大舒张百分率分别为(67.24±17.55)%、(68.52±6.74)%、(75.64±14.62)%和(42.24±14.59)%]。三组用药组之间比较差异无统计学意义(P ＞0.05),见图 1。

图1 各组大鼠胸主动脉对Ach诱导的舒张反应(%)

2.3 对L-NAME预处理的胸主动脉舒张功能的影响 经LNAM E预处理后,大鼠胸主动脉对低、高浓度的Ach诱发的舒张反应,模型组较假手术组均显示舒张率显著下降(P＜0.05),最大舒张百分率显著低于假手术组[(5.64±3.06)%∶(20.42±15.34)%,P＜0.05]。TFH 组、CP组、TFH+CP组对不同浓度的Ach诱发的舒张反应均显示不同程度下降,其中TFH+CP组与模型组比较下降幅度最小(P＜0.05),最大舒张百分率显著高于模型组[(17.48±2.73)%∶(5.64±3.05)%,P＜0.05]。三组用药组之间比较差异无统计学意义(P＞0.05),见图 2。

图2 各组经L-NAME预处理的大鼠胸主动脉对Ach诱导的舒张反应(%)

2.4 对胸主动脉收缩功能的影响 模型组大鼠胸主动脉对低、高浓度的NE的收缩敏感性显著高于其他各组,其最大收缩百分率较假手术组显著升高[(92.02±2.75)%∶(78.46±16.15)%,P＜0.05]。TFH 组、CP组、TFH+CP组对不同浓度的NE的收缩敏感性均不同程度降低,TFH组与模型组比较,在NE较低浓度(10-7～10-5mol/L)时,收缩敏感性显著降低(P＜0.05)。CP组与模型组比较,在 NE较低浓度(10-7～10-6mol/L)时,收缩敏感性显著降低(P＜0.05)。TFH+CP组对低、高浓度的NE的收缩敏感性显著低于模型组,其最大收缩百分率与模型组比较差异有统计学意义[(76.26±12.40)%∶(92.02±2.75)%,P＜0.05]。三组用药组之间比较无统计学差异(P＞0.05),见图3。

图3 各组大鼠胸主动脉对NE的收缩反应(%)

3 讨 论

1936年Szent-Gyorgyi首次对植物黄酮的有效成分槲皮素(Que)进行了分离鉴定,20世纪70年代华西医科大学药物研究所从野生胡颓子科植物醋柳(俗称沙棘)的果实中提取出一种有效成分TFH。目前,从沙棘中提取的TFH已广泛应用于冠心病和高血压的治疗,取得了较好的疗效,但是其降压机制并不很明确。

本实验采用的腹主动脉缩窄高血压大鼠模型是筛选降压药常用的动物模型。早期由于腹主动脉缩窄引起机械性血管阻力增加,后期由于缩窄引起肾血流减少,导致肾脏灌注不足,激活体内的肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS),引起血压升高。本实验复制动物模型后,随机抽样血压均大于150 mm Hg,建模成功。

实验观察到,模型组大鼠胸主动脉环存在舒缩功能的异常,其胸主动脉环对Ach诱发的内皮依赖性舒张反应比其他各组明显减弱,TFH组、CP组、TFH+CP组均能不同程度改善大鼠胸主动脉环对Ach诱发的内皮依赖性舒张,与模型组比较舒张率显著升高(P＜0.05)。说明模型组高血压大鼠可能存在血管内皮功能障碍,而TFH和CP对血管内皮有保护作用。经NO合成酶抑制剂L-NAME预处理的模型组大鼠胸主动脉环对不同浓度的Ach诱发的舒张反应均显示舒张率下降,与假手术组和 TFH+CP组比较舒张率显著下降(P＜0.05)。进一步说明了模型组高血压大鼠可能存在血管内皮功能障碍,而TFH和CP对血管内皮有协同保护作用,其扩血管作用与NO有关。

众所周知,内皮细胞依赖舒张活性降低及内皮依赖收缩作用增加等内皮细胞功能紊乱,与高血压发生发展有密切联系。因此保护内皮细胞、增加血NO的水平,是治疗高血压的重要途径之一。国外文献表明,黄酮类表现内皮依赖性血管扩张作用,当内皮去除时降低了其舒张反应的敏感性而没有影响最大舒张反应[2];而Que经葡萄苷酸化或硫酸化的代谢产物没有直接的血管舒张作用[3]。Que和Iso可以通过抑制NADPH氧化酶介导的超氧阴离子的产生、减少p47的过度表达和增强内皮型一氧化氮合酶(eNOS)活性,使NO生物学活性提高,从而防止血管紧张素Ⅱ诱导的内皮损害和发挥抗高血压的作用[4-5]。此外,Que可抑制氧化物在细胞内的蓄积及细胞核内磷酸化p53蛋白的转活,从而降低因氧化诱导引起的内皮细胞凋亡[6]。Iso可抑制氧化型低密度脂蛋白损伤引起的凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体1和Caspase23 mRNA表达上调,以及通过p38MAPK途径在转录水平影响内皮细胞功能相关蛋白,如eNOS的表达,最终增加 NO 释放[7-8]。Roghani等[9]应用血管环技术研究Que对链唑霉素诱导的糖尿病大鼠血管舒张的影响,表明Que可以舒张血管,且有内皮依赖性,可能通过NO及前列腺素介导的途径。在本实验中给腹主动脉缩窄大鼠长期服用TFH能明显提高血管对Ach的舒张反应,实验结果与Ajay等[10]的研究结果相似。以上说明黄酮类药物可以保护血管内皮细胞、刺激内皮源性NO增加而舒张血管。为了进一步证明此机制,本实验还通过直接检测大鼠血清NO的浓度变化,观察到 TFH用药组(TFH组和 TFH+CP组)的血清NO浓度较模型组显著升高(P＜0.01),且较CP组升高更明显(P＜0.05)。国内的临床研究[11]也表明 TFH具有改善高血压患者一氧化氮、内皮素合成,纠正内皮功能不良的作用。有文献报道了TFH对大鼠离体胸主动脉环的舒张作用及其与内皮的关系[12-13],发现THF呈剂量依赖性扩血管作用,其舒张血管的机制与内皮NO有关。

另外,实验观察到,对NE诱发的收缩反应,模型组大鼠胸主动脉环的收缩敏感性显著高于其他各组(P＜0.05),TFH组、CP组、TFH+CP组对不同浓度的NE的收缩敏感性均不同程度降低。说明模型组高血压大鼠对交感神经末梢释放的NE,其收缩敏感性升高,而TFH和CP对交感神经兴奋引起的血管收缩有抑制作用,且有协同降压作用,它们的作用机制除了保护内皮细胞,增加血NO水平外,还可能与对血管紧张素转换酶的抑制作用有关。

TFH及其单体Que、Iso对血浆及培养的主动脉平滑肌细胞(ASMCs)血管紧张素转换酶(ACE)活性有抑制作用[14-16],可以改善胰岛素敏感性和阻断AngⅡ信号传导通路[17],另外Que可以增加尿的排出量、促进尿钠排出、降低醛固酮和血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1a)mRNA水平[18]。因此它们确有降压及保护靶器官的作用。Edwards等[19]研究表明Que治疗高血压具有可靠的安全性和良好的应用前景。常彬宾等[20]采用Meta分析,系统评价了TFH治疗原发性高血压的有效性、安全性和成本效果,表明TFH能有效降低收缩压和舒张压,对心脏和肾脏有保护作用,不良反应较少,而且经济学效果较好。综上所述,TFH及其单体有确切的降压效果,长期服用可以改善高血压大鼠血管内皮舒张功能,降低血管对缩血管物质的敏感性,其机制与保护血管内皮、刺激内皮源性NO增加,以及抑制血管紧张素转换酶有关。TFH的舒血管作用与卡托普利等效,两药联用具有协同作用,能更理想的控制血压。

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