天花粉对脑缺血再灌注大鼠高同型半胱氨酸血症的影响

陈 威 王 红 张思为

暨南大学第二临床医学院（广东深圳518020）

研究表明，高同型半胱氨酸血症（Hhcy）可能是继高血压、高血脂、糖尿病、心脏病等传统缺血性脑血管病发病的危险因素外一个新的独立危险因素［1］。笔者采用大鼠大脑中动脉栓塞（MCAO）建立局灶性脑缺血再灌注（CIR）损伤模型，观察天花粉对Hhcy大鼠CIR后细胞周期蛋白A（cyclinA）表达的影响，探讨养阴法对缺血后神经元损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料健康成年雄性SD大鼠72只，体质量200～250g，由广东省实验动物中心提供。天花粉精制液、补阳还五汤精制液，质量浓度为1.0g/mL（深圳市人民医院制剂中心制备）。

1.2 模型制作SD大鼠随机分为假手术、模型组、天花粉组、补阳还五汤组，每组各18只。各组根据缺血再灌注时间分为12、24、48h 3个亚组。线栓直径为0.22～0.25mm的钓鱼线，将一端轻轻沾上硅胶作成线栓头（直径约为0.28～0.30mm），阴干后用刻度尺测量距线栓头18mm及20mm处用记号笔标记记号，将线栓置于75%酒精中备用。参考Zea Longa［2］的模型制作方法进行造模。大鼠用10%水合氯醛（350mg/kg）腹腔注射麻醉，分离左侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉和翼腭动脉。结扎翼腭动脉，然后在距颈总动脉分叉1cm处结扎颈外动脉，并于距结扎处近端约0.5cm处远心端用电凝器灼断之。动脉夹夹闭左颈总动脉，在颈外动脉剪一切口，将一长5cm，直径0.126mm尼龙线经左侧颈外动脉主干切口缓慢向颈内动脉入颅方向推进，以颈总动脉分叉处为标记，推进18～20mm感到轻微阻力时，即阻断大脑中动脉，将线拴系紧防止滑出。阻断3h后，拨出尼龙线至有轻微阻力时止，此时血流灌注成功，完成脑缺血再灌注损伤模型。假手术组除不插线外，全过程同其他各组。造模成功率为75%，死亡后补充动物。

1.3 给药方法实验前7d称取体质量后灌胃，2mL/100g，每日2次，分别在上午8：30和下午5：00进行。假手术组予生理盐水，模型组、天花粉组及补阳还五汤组以L-蛋氨酸1g/（kg·d）灌胃，天花粉组和补阳还五汤组分别给相应药液。采用盲法给药，给药由专人负责，造模者回避。

1.4 神经病学评分标准各组动物在12、24、48h各个时间点处死前按照Longa的5分法评分标准进行［2］：无神经缺损为0分；提尾时左前肢内收，不能完全伸直为1分；行走向左倾倒为2分；向左旋转为3分；不能自己行走或昏迷为4分。1～4分为有效模型。

1.5 血浆中Hcy含量检测各组大鼠在不同时间点抽血2mL，置含有20g/L乙二胺四乙酸二钠100mL的一次性试管中，离心分离出血浆标本置70℃保存，待标本收集全后，应用高效液相色谱法检测血浆Hcy。

1.6 免疫组化测定分别于脑缺血再灌注12、24、48h各时间点用10%水合氯醛（0.35mL/100g）麻醉大鼠，4%的多聚甲醛灌注固定后断头取脑，于4%的多聚甲醛中浸泡24h，自视交叉向前后2mm切取冠状脑片，取第3片行石蜡包埋，连续切片。石蜡切片脱蜡水化；用柠檬酸缓冲液（pH6.0）微波修复20min。滴加 50μL的兔多克隆 cyclin A 抗体（1∶100），置湿盒中 4℃过夜；冲洗后滴加50μL聚合物增强剂，室温下孵育20min；冲洗后滴加50μL酶标抗兔聚合物，室温下孵育50min；冲洗后DAB镜下显色2～3min。阴性对照：用PBS代替兔多抗，其余步骤同前。阳性对照：应用肠癌石蜡切片制作阳性对照片，其余步骤同前。

1.7 统计学处理有关变量用（±s）表示，数据统计分析采用双因素方差分析，整体上考察药物处理因素与时间因素对结果的影响有无交叉，再通过单因素方差分析对各个时间点数据进行分析。单因素方差分析两两比较，如果尚不能确认方差不齐，则采用Bonferroni检验，如果已经确定方差不齐，则采用Tamhane’s T2检验。使用SPSS 13.0软件进行统计分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组神经功能评分比较见表1。神经学症状评分时间因素与药物分组因素之间不存在交互作用。与模型组比较，天花粉组、补阳还五汤组神经功能得到显著改善（P＜0.05或0.01）；天花粉组、补阳还五汤组之间差别不明显（P＞0.05）。

表1 各组不同时间点神经功能评分（分，±s）

表1 各组不同时间点神经功能评分（分，±s）

与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。 下同。

组 别 n 再灌注12h再灌注24h再灌注48h药物主效应假手术组 18 0 0 0 0模型组 18 3.17±0.75 2.83±0.75 2.67±0.52 2.89±0.68补阳还五汤组 18 2.67±0.82* 2.33±0.52*2.17±0.41* 2.38±0.61*天花粉组 18 2.50±0.84**2.17±0.75**1.83±0.75**2.16±0.79**

2.2 各组血浆中Hcy含量比较见表2。血浆中Hcy含量时间因素与药物分组因素之间存在交互作用。与模型组比较，天花粉组、补阳还五汤组Hcy含量减少（P＜0.05或0.01）；缺血再灌注24h，天花粉组与补阳还五汤组比较也显著减少（P＜0.05）。

表2 各组不同时间点血浆Hcy含量比较（μmol/L，±s）

表2 各组不同时间点血浆Hcy含量比较（μmol/L，±s）

与补阳还五汤组比较，△P＜0.05。下同。

组 别 n 再灌注12h 再灌注24h 再灌注48h假手术组 18 3.67±1.17 3.02±0.88 3.09±0.82模型组 18 19.92±2.31 37.39±2.91 36.35±1.12补阳还五汤组 18 10.84±1.09* 18.80±1.47* 16.94±1.17*天花粉组 18 10.40±1.32** 15.22±1.25**△ 15.01±1.55**△

2.3 各组cyclin A表达比较见表3。cyclin A阳性细胞数时间因素与药物分组因素之间存在交互作用。缺血再灌注各时间点，与模型组比较，天花粉组、补阳还五汤组阳性细胞数显著减少（P＜0.05或0.01）；缺血再灌注24h和缺血再灌注 48h，天花粉组与补阳还五汤组比较也显著减少（P＜0.05）。

表3 各组不同时间点cyclinA阳性细胞数比较 （±s）

表3 各组不同时间点cyclinA阳性细胞数比较 （±s）

组 别 n 再灌注12h 再灌注24h 再灌注48h假手术组 18 3.11±1.45 3.28±1.40 2.0±1.03模型组 18 25.67±3.74 34.67±3.34 28.53±4.85补阳还五汤组 18 17.67±2.27* 20.16±3.38* 19.00±0.84*天花粉组 18 16.33±1.28** 16.0±2.45**△ 16.47±3.10**△

3 讨 论

中风的病机以气虚血瘀、阻滞脉络为主，本研究表明尚存在阴津亏虚。津血同源同行，津荣则血旺、津运则血畅，若阴津不足，脉道枯涩，则脉络瘀阻，产生瘀血，痹阻于脑络，发为中风。故本研究重用养阴药天花粉，滋补阴液、增水行血、濡润脉道，以利血行，从而达到防治缺血性中风的目的。

脑缺血再灌注损伤是指脑缺血恢复血液灌注后，脑细胞损伤反而进行性加重的过程。在此过程中Hhcy可能加重脑细胞损伤。目前研究发现，Hhcy对脑梗死影响的机制主要为（1）Hhcy对血管内皮结构和功能的影响。血管内皮细胞对调节和维持血管系统的正常功能起着重要作用。内皮细胞为覆盖在血管内表面的单层扁平细胞，正常内皮细胞既是感应细胞又是效应细胞，能感知血液中的炎症信号、激素水平、切应力、血压等信息。在感知物理和化学因素刺激后，可合成和分泌多种血管活性物质，如内皮衍生的松弛因子（EDRF）、前列腺素 （PGs）、内皮素 （ET）、血管紧张素Ⅱ、血栓素 A2（TXA2）等，这些活性物质对血管舒缩功能的调节、凝血和抗凝血都有重要的作用。内皮细胞的损伤在动脉粥样硬化（AS）的形成过程中具有重要的始动作用。Hhcy可能通过氧化应激机制导致内皮细胞出现坏死、凋亡等损伤改变。有研究认为，Hhcy可通过细胞内外浓度梯度和转运装置被动或主动地转运到细胞内，通过巯基发生自氧化，产生过氧化氢、羟自由基 （·OH）、超氧阴离子等，发生氧化应激反应。当金属离子铁、铜存在时，Hcy产生具有强烈细胞毒性的OH-OH-可作用于细胞膜内不饱和脂肪酸，启动膜脂质过氧化链式反应，造成血管内皮细胞凋亡，功能丧失，导致动脉硬化［3］。Hcy是一种炎症刺激物，它可以刺激内皮细胞产生多种趋化因子和黏附分子损伤内皮细胞，导致动脉粥样硬化发生。在病理情况下，VCAM-1在内皮细胞表面表达异常增多。LiM等［4］也证实Hcy能促进内皮细胞表达和分泌VCAM-1，导致血管炎性损伤。（2）Hhcy促进血小板聚集，Hcy可抑制内皮细胞 ADP酶的活性，致使二磷酸腺苷（ADP）降解减少，凝血酶和 ADP可以改变花生四烯酸的代谢，促进 TXA2合成增多，引起血小板聚集，血小板在内皮细胞的黏附和聚集也是促进凝血过程瀑布反应的重要因素［5］。（3）Hhcy还可分别增加cyclin D和cyclin A的信使核糖核酸（mRNA）水平3倍和15倍，提示Hhcy诱导的cyclin的mRNA合成，对鼠主动脉平滑肌细胞由静止期进入增殖期起主要作用。cyclin A蛋白是细胞周期由G1期向S期转变过程中的一种重要调节蛋白，它的表达标志着细胞周期进入到G1晚期或G1晚期的机制激活。

本实验中，与模型组比较，天花粉组、补阳还五汤组各时间点血浆Hcy显著降低，表明天花粉及补阳还五汤均能减少血浆Hcy，从而达到减轻脑缺血再灌注损伤的作用。脑缺血再灌注损伤能够诱导Hhcy的出现，从而刺激大鼠脑内的神经元异常表达cyclin A蛋白，加重脑细胞的损伤，天花粉及补阳还五汤均可减少cyclin A蛋白的表达，其机制可能是通过减少血浆Hcy的含量。

［1］Mcllroy SP，Dynan KB，Laws on JT，et al.Moderately elevated plasma homoxysteine，methylenetetra，hydrofolate reductase genotype，and risk for stroke，vascular demention and Alzheimer disease in Northern Ireland［J］.Stroke，2002，33（10）：2351.

［2］Bederson JB，Pitts LH，Tsuji M，et al.Rat middle cerebral artery occlusion：evaluation of the model and development of a neurologic examination［J］.Stroke，1986，17（3）：472.

［3］Dayal S，Arning E，Bottiglieri T，et al.Cerebral vascular dysfunction mediated by superoxide in hyperhomocysteinemic mice［J］.Stroke，2004，35 （8）：1957.

［4］Li M，Chen J，Li YS，et al.Folic acid reduces adhesion molecules VCAM-1 expession in aortic of rats with hyperhomocysteinemia［J］.Int J Cardiol，2006，106（2）：285.

［5］Dardik R，Varon D，Tamarin I，et al.Homocysteine and oxidized low density lipoprotein enhanced platelet adhesion t o endothelial cells under flow conditions；distinct mechanisms of thrombgenic modulation［J］.T Hromb Haenost，2000，83（5）：338.