山茱萸水提取物对Hela细胞体外增殖的影响

何 杨，段 斐，靳 祎，王恩军

(1河北大学基础医学院，河北保定071000;2华北油田总医院)

山茱萸为山茱萸科植物山茱萸(Fructus Corni)的干燥果肉，又名山萸肉、药枣、肉枣等。其味酸、涩、微温，归肝肾经，有补益肝肾、涩精固脱之功效，是我国的传统中药材［1，2］。现代药理研究发现山茱萸对肿瘤细胞有明显的抑制作用［3～5］。2010年5～11月，我们采用人宫颈癌Hela细胞作为实验模型，研究山茱萸水提取物体外抗宫颈癌活性，探讨山茱萸的抗癌机制，为其临床应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料 山茱萸水提取物由河北农业大学生命科学院提供，每1 g相当于原生药2 g。制成500 mg/ml的溶液，高压灭菌4℃保存，原生药购自河北安国。人宫颈癌细胞株Hela由河北农业大学生命科学院提供。

1.2 仪器与试剂 CO2培养箱:美国SHELDON公司;净化工作台:苏净集团苏州安泰空气技术有限公司;酶标仪:郑州博塞生物工程公司;倒置显微镜:上海光学仪器五厂;48孔及96孔培养板:美国Costar公司;胎牛血清:杭州四季青生物工程材料有限公司;DMEM培养液和胰蛋白酶:GIBCO公司;顺铂:齐鲁制药有限公司;四甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO):美国Sigma公司;琼脂糖:北京拜尔迪生物公司;200 bp DNAmaker:华美生物工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养 将Hela细胞贴壁生长于DMEM完全培养液体系(含10%胎牛血清，青霉素和链霉素各100 U/ml)，置于37℃、饱和湿度、5%CO2的培养箱中进行培养，待细胞长至对数生长期时用DMEM完全培养基将细胞浓度调整为1×105个/ml的细胞悬液待用。

1.3.2 MTT法检测山茱萸水提取物对Hela细胞增殖的抑制作用 按1×105个/ml的细胞密度将Hela细胞接种到96孔培养板中，终体积为每孔200 μl。实验分3组，阴性对照组加入生理盐水，阳性对照组加入顺铂(浓度为20 μg/ml)，实验组加入不同剂量的山茱萸水提取物，分别为每孔10、20、40、80 μl，并设4个平行孔，分别培养24、48和72 h后加入 MTT 液(5 μg/μl)20 μl，继续培养4 h，弃上清液，加入DMSO每孔150 μl，震荡15min，测定吸光度值(OD值)，测定波长 λ=570 nm，参考波长 λ=630 nm，计算抑制率=(对照组OD值－实验组OD值)/对照组OD值×100%。

1.3.3 形态学观察 取对数生长期的Hela细胞接种于48孔细胞培养板内，培养24 h，实验组每孔加入20 μl的山茱萸水提取物，对照组加入生理盐水，培养48 h后在倒置显微镜下观察细胞的形态变化。

1.3.4 DNA琼脂糖凝胶电泳分析 取对数生长期细胞5瓶，每瓶含有1×106个细胞，用细胞培养液把山茱萸水提取物稀释成不同浓度(0、25、50、100、200 mg/ml)，分别加入5个培养瓶中，加培养液至5 ml，培养48 h后用原有培养液吹起细胞，收集离心，吸去上清液，加入1 ml磷酸缓冲液洗两次，然后提取DNA，在2%琼脂糖凝胶上电泳2 h，电压为80 V，紫外透视仪观察、拍照。

1.3.5 统计学方法 采用 The SAS system 6.12软件进行统计学处理。计量数据以±s表示，采用t检验和双因素方差分析(F检验)。以P≤0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 对Hela细胞增殖的抑制作用 各组作用48 h后对Hela细胞抑制作用比较见表1;山茱萸水提取物对Hela细胞抑制作用的时效关系见表2。

表1 各组作用48 h后对Hela细胞抑制作用比较(n=4，±s)

表1 各组作用48 h后对Hela细胞抑制作用比较(n=4，±s)

注:与阴性对照组比较，*P ＜0.05，△P ＜0.01

组别 OD值 抑制率(%)0.219 ±0.012 －阳性对照组 0.021±0.025△ 90.40±0.20△实验组10 μl 0.106 ±0.033* 51.22 ±0.23*20 μl 0.077 ±0.014△ 60.51 ±0.33△40 μl 0.038 ±0.032△ 82.46 ±0.41△80 μl 0.023 ±0.026△ 89.53 ±0.17阴性对照组△

表2 山茱萸水提取物对Hela细胞抑制作用的时效关系(n=4，±s)

表2 山茱萸水提取物对Hela细胞抑制作用的时效关系(n=4，±s)

注:与24 h比较，*P ＜0.05，△P ＜0.01

24 h 48 h 72 h 10 μl 44.28 ±0.24 51.22 ±0.23* 54.16 ±0.27剂量 抑制率(%)△20 μl 53.60 ±0.47 60.51 ±0.33* 61.31 ±0.18*40 μl 76.43 ±0.19 82.46 ±0.41* 82.64 ±0.30*80 μl 84.52 ±0.31 89.53 ±0.17* 90.15 ±0.39*

2.2 形态学观察 对照组宫颈癌Hela细胞呈扁平的不规则长梭形或多角形，核圆形，位于中央，排列无方向性，细胞边缘清楚，培养基内悬浮的细胞和碎片少。实验组山茱萸水提取物作用Hela细胞，胞膜起皱，细胞呈圆形，细胞膜完整，培养基内悬浮的细胞和碎片多。

2.3 DNA凋亡带的观察 Hela细胞经不同浓度山茱萸水提取物处理48 h后，电泳检测均可见断裂DNA片段，细胞DNA呈现典型的180～200 bp的梯形条带，即为“DNA Ladder”。表明一定量的山茱萸水提取物可诱导Hela细胞凋亡。

3 讨论

宫颈癌是一种严重危害妇女健康和生命的生殖系统恶性肿瘤，在全球妇女恶性肿瘤中仅次于乳腺癌。临床上宫颈癌主要采取手术、放化疗等综合治疗，但它们所带来的并发症也很多，而且化疗药物本身费用昂贵、久易耐药、毒性较大。而传统中医药积累了大量治疗妇科疾病的经验与验方，辨证论治对减少宫颈癌化疗和放疗的副作用均有较好的辅助作用，这对巩固和加强宫颈癌的治疗效果，延长患者生命和保证生存质量是具有积极意义的［6］。

关于山茱萸的药理活性，目前报道较多的有其抗衰老、增强免疫的作用，而其他研究却甚少。本实验使用人宫颈癌Hela细胞作为代表细胞株，采用MTT法观察山茱萸水提取物对人宫颈癌细胞的作用。结果表明，不同剂量山茱萸水提取物处理细胞后，Hela对MTT的代谢能力均有不同程度的降低，山茱萸水提取物对Hela细胞增殖有较强的抑制作用，抑制程度与山茱萸水提取物的浓度和作用时间有关。另外山茱萸水提取物作用于细胞后，可见较为典型的细胞凋亡的形态学变化，而且不同剂量山茱萸水提取物作用于Hela细胞后，细胞的生长受到明显抑制，有DNA Ladder凋亡条带的出现，说明山茱萸水提取物能诱导 Hela细胞凋亡［7，8］，这为今后进一步研究山茱萸的抗肿瘤作用机制提供了实验依据。

［1］张聪，金德庄.山茱萸的研究进展［J］.上海医药，2008，29(10):464-467.

［2］李满郁，王艳铭，杨立伟.山茱萸药理作用研究［J］.中医药信息，2005，22(4):33.

［3］张兰桐，袁志芳，杜英峰，等.山茱萸的研究近况及开发前景［J］.中草药，2004，35(8):952-955.

［4］刘洪，许惠琴.山茱萸及其主要成分的药理学研究进展［J］.南京中医药大学学报，2003，19(4):254-256.

［5］季宇彬.中药多糖的化学与药理［M］.北京:人民卫生出版社，2005:226-230.

［6］关素洁.宫颈癌的发病机制及中医药治疗研究进展［J］.中医药导报，2007，13(2):95-97.

［7］赵令武，万福生.中草药诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡及其分子机制［J］.江西医学院学报，2006，46(5):176.

［8］杨萍，于廷曦，马润娣，等.土贝母皂苷诱导人宫颈癌Hela细胞周期阻滞和细胞凋亡［J］.癌症，2002，21(4):346-350.