艾迪注射液对大肠癌细胞的生长抑制作用观察及相关机制探讨

张俊华，张银旭，左 腾，王亚华

(1辽宁医学院附属第一医院，辽宁锦州121001;2辽宁省兴城市核工业部246医院)

临床应用发现，艾迪注射液是有确切疗效的抗癌制剂，但其作用机制仍不十分明确。从中医学的角度来说，瘀血内阻是发生恶性肿瘤的重要病机。2011年3～9月，我们观察了艾迪注射液对大肠癌SW620细胞的生长抑制作用，并通过诱导人单核白血病细胞(THP-1)分化成为M2型巨噬细胞(M2φ)建立模拟肿瘤的微环境，观察大肠癌SW620细胞的上皮—间质转化情况，以探讨艾迪注射液抗肿瘤的相关机制。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 人单核白血病细胞(THP-1)，SW620细胞。佛波酯，IL-4，RPMI1640培养液，胎牛血清，4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，胰酶及噻唑蓝(MTT)，二甲基亚砜(DMSO)。艾迪注射液。TranswellTM培养板，CD68及 CD163流式抗体，E-钙黏素(E-cadherin)及波形蛋白(Vimentin)。蛋白免疫印迹相关抗体及ELISA试剂盒。

1.2 实验方法

1.2.1 艾迪注射液对SW620细胞的抑制作用观察

采用MTT实验。选对数生长期的SW620细胞，以每孔5 000个接种于96孔板，贴壁后弃去培养液，分别加入终浓度为 20、40、60、80、100 mg/ml的艾迪注射液100 μl(实验组)，以不加艾迪注射液、正常培养的SW620细胞作对照(对照组)。两组培养3 d后弃去上清，各加入100 μl的MTT试剂，继续培养4 h后取出，加入DMSO显色后测各组光密度值(OD值)。实验组SW620细胞生长抑制率=(OD对照组－OD实验组)/OD对照组×100%。

1.2.2 模拟肿瘤微环境的建立 将THP-1细胞置于含10%胎牛血清、2 g/L碳酸氢钠、100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素及20 mmol/L HEPES的RPMI 1640培养基中，放入37℃、5%CO2培养箱中培养，3 d传代1次。取对数生长期THP-1细胞按2.5×105/ml的密度接种于6孔板中，每孔加入含200 nmol/L佛波酯的培养液4 ml，培养3 d。用PBS充分洗涤3次，去除不贴壁和死亡细胞。每孔加入含10 ng/ml的 IL-4 10 ng/ml培养液24 h，流式细胞仪检测其表面CD68、CD163抗原为阳性，证明THP-1已被诱导分化成M2φ。收集M2φ，接种于TranswellTM培养板的上层小室里，即为体外肿瘤微环境模型。

1.2.3 艾迪注射液对模拟肿瘤微环境中细胞培养上清液 TNF-α、TGF-β 及 SW620 细胞 E-cadherin、Vimentin蛋白表达的影响 将相同数目对数生长期的SW620接种于上述Transwell培养板下层小室，分别加入终浓度为20、60、100 mg/ml的艾迪注射液作为实验组，以不加艾迪注射液、单独培养的SW620细胞以及不加艾迪注射液、接种于上述TranswellTM培养板下层小室的SW620细胞作对照(分别为对照1、2组)。于 24、48、72 h 收集各组培养上清液，用ELISA法测TNF-α、TGF-β;收集各组模型底层小室里的 SW620细胞，用 Western blot法测细胞中的E-cadherin、Vimentin蛋白(以目的蛋白灰度值与βactin灰度值的比值表示)。

1.3 统计学方法 采用SPSS14.0统计软件。数据比较用t检验、方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 艾迪注射液对SW620细胞的抑制作用 20、40、60、80、100 mg/ml的艾迪注射液对 SW620 细胞的生长抑制率分别为37.35%±3.47%、45.91%±4.59%、76.39%± 2.33%、81.55%± 1.84% 及83.27%±1.56%，随艾迪注射液浓度的增加，细胞的生长抑制率逐渐上升(P均＜0.05)。

2.2 各组细胞培养液中TNF-α、TGF-β的表达比较见表1。

2.3 各组SW620中E-cadherin、Vimentin的表达比较 见表2。

3 讨论

表1 各组细胞培养液中 TNF-α、TGF-β的表达比较(ng/ml，±s)

表1 各组细胞培养液中 TNF-α、TGF-β的表达比较(ng/ml，±s)

注:与对照1 组相比，*P ＜0.05;与对照2组相比，△P ＜0.05;与同组前一时间点相比，#P ＜0.05

组别 TNF-α TGF-β 24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h实验组20 mg/ml 35.23±0.92＊△ 0.35±2.46*#△ 14.97±1.92*#△ 2.34±0.22＊△ 3.45±0.30*#△ 4.46±0.39*#△60 mg/ml 11.63±1.72＊△ 11.63±1.72＊△ 7.38±2.33*#△ 0.89±0.31＊△ 0.67±0.27*#△ 0.56±0.44*#△100 mg/ml 0.75±0.27＊△ 0.39±0.93＊△# 0.66±0.53＊△ 0.73±0.26＊△ 0.57±0.38*#△ 0.67±0.40＊△对照1 组 36.35±0.45 37.66±0.36#△ 39.32±0.32#△ 3.37±0.21 4.35±0.31#△ 5.46±0.19#△对照2 组 38.24±0.31* 39.88±0.42*# 40.37±0.54*# 4.13±0.32* 5.07±0.41*# 6.67±0.39*#

表2 各组SW620中E-cadherin、Vimentin的表达比较(±s)

表2 各组SW620中E-cadherin、Vimentin的表达比较(±s)

注:与对照1 组相比，*P ＜0.05;与对照2组相比，△P ＜0.05;与同组前一时间点相比，#P ＜0.05

组别E-cadherin Vimentin 24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h实验组20 mg/ml 0.42±0.01＊△ 0.36±0.02*#△ 0.24±0.13*#△ 0.32±0.03＊△ 0.37±0.13*#△ 0.56±0.19*#△60 mg/ml 0.36±0.10＊△ 0.38±0.03*#△ 0.39±0.10＊△ 0.12±0.05＊△ 0.20±0.03*#△ 0.37±0.02*#△100 mg/ml 0.25±0.11＊△ 0.36±0.14*#△ 0.46±0.18*#△ 0.10±0.03＊△ 0.06±0.03*#△ 0.01±0.01*#△对照1 组 0.98±0.32△ 0.98±0.29△ 0.97±0.30△ 0.01±0.01 0.01±0.01△ 0.01±0.01△对照2 组 0.78±0.20* 0.43±0.24*# 0.22±0.23*# 0.33±0.04 0.48±0.07*# 0.89±0.10*#

艾迪注射液的主要成分是人参、黄芪、刺五加、斑蝥的提取物，在临床中广泛用于治疗原发性肝癌、肺癌、肠癌、等多种肿瘤。本研究结果显示，艾迪注射液抑制了大肠癌SW620细胞的生长，其抑制率随着药物浓度的增加而上升。

肿瘤微环境中的各种细胞，如肿瘤相关巨噬细胞、肥大细胞、癌症相关成纤维细胞、表达TIE-2的单核细胞、中性粒、淋巴细胞以及树突状细胞等都起到各种促进或抑制肿瘤发展和转移的作用［1］。其中M2φ的作用较为突出，且与上皮—间质转化的发生有关。TNF-α是一种有广泛作用的细胞因子，它能造成一些肿瘤细胞系的坏死，但通过Snail途径也能诱导细胞发生增殖与分化［2］。不少学者的研究证实TGF-β的高表达能促进上皮—间质转化的发生［3～5］。

E-cadherin是钙黏素超家族中的一员，它的表达降低会造成组织细胞间的黏附力下降，且增加细胞的活动能力，使其能穿过基底膜，侵犯周围组织，造成肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移［6］。Vimentin是间质细胞表达的一种Ⅲ型中间丝，是间质细胞骨架的重要组成部分，在保持细胞完整性方面发回重要作用，常用作间质细胞的标记物［7］。本研究发现，在模拟肿瘤位环境中，不加入艾迪注射液时，培养上清液中 TNF-α、TGF-β 表达增加，E-cadherin的表达减少，Vimentin的表达增加，证实M2φ在和SW620共培养时促进了SW620细胞的上皮—间质转化，从而使其具有远端转移的能力。另外，在模拟肿瘤位环境中加入艾迪注射液后，随着药物浓度增加及培养时间的延长，细胞培养液中TNF-α和TGF-β的表达逐渐降低，说明艾迪注射液降低了这两种物质的表达，抑制了SW620细胞的增殖以及上皮—间质转化;同时随着艾迪注射液浓度增加及培养时间的延长，SW620细胞的E-cadherin表达逐渐增加而Vimentin的表达逐渐恢复未加药时的低水平。由此认为艾迪注射液的干预逆转了大肠癌SW620上皮细胞向间质细胞的转化。

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［2］Yamauchi Y ，Kohyama T，Takizawa H，et al.Tumor necrosis factor-alpha enhances both epithelial-mesenchymal transition and cell contraction induced in A549 human alveolar epithelial cells by transforming growth factor-beta1［J］.Experimental lung research，2010，36(1):12-24.

［3］Flier SN，Tanjore H，Kokkotou EG，et al.Identification of epithelial to mesenchymal transition as a novel source of fibroblasts in intestinal fibrosis［J］.Biol Chem，2010，285(26):20202-20212.

［4］Stover DG，Bierie B，Moses HL.A delicate balance:TGF-beta and the tumor microenvironment［J］.Cell Biochem，2007，101(4):851-861.

［5］Zavadil J，Bottinger EP.TGF-beta and epithelial to mesenchymal transitions［J］.Oncogene，2005，24(11):5764-5774.

［6］于秀文，荣玮，徐凤琳，等.黏蛋白和上皮钙粘附蛋白在结直肠肿瘤组织中的表达及其意义［J］.癌症，2007，26(11):1204-1210.

［7］Otsuki S，Inokuchi M，Enjoji M，et al.Vimentin expression is associated with decreased survival in gastric cancer［J］.Oncol Rep，2011，25(5):1235-1242.