巴曲酶对大鼠脑缺血再灌注Fas基因和FasL基因表达变化的影响

白文婷

脑缺血再灌注后以神经元为主的坏死和细胞凋亡是缺血性脑损伤中重要的病理生理过程,其中细胞凋亡的重要作用越来越受到人们重视。导致细胞凋亡的通路有多条,其中Fas和FasL系统是细胞凋亡中最重要的途径之一[1,2]。巴曲酶是目前比较公认的治疗缺血性脑血管病的药物之一,本研究从基因表达角度观察巴曲酶对脑缺血再灌注损伤后Fas、FasL基因较表达水平的影响,为临床应用提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 动物模型的建立与分组 选用健康W ister大鼠40只,雌雄不拘,体质量200～250 g,由哈尔滨医科大学实验动物中心提供,并随机分为5组,即Ⅰ组为假手术组,Ⅱa组为等渗盐水缺血6 h组,Ⅱb为等渗盐水缺血6 h再灌注6 h组(分别于缺血后2 h予以腹腔注射0.9%生理盐水1 m l),Ⅲa组为巴曲酶缺血6 h组,Ⅲb组为巴曲酶缺血6 h再灌注6 h组[与生理盐水组同时间同途径注射巴曲酶注射液8 BU/kg(用生理盐水衡释为1 m l)],每组各8只。模型的建立参照Zez-Longe法[3,4]并改良,大鼠麻醉后分离结扎右侧颈总动脉、颈外动脉,颈内动脉放置动脉夹,在近动脉分叉处约5 mm剪一小口,用直径0.17 mm的尼龙线(头端膨大直径约为0.25mm)插入颈内动脉约(19.0±0.5)mm,遇阻即止,闭塞大鼠清醒后爬行时向左转圈或提尾时左前肢内收屈曲为入组标准。每组大鼠于规定时间点快速断头取脑,剥取右侧大脑额顶叶上部皮质,液氮中冻存。

1.2 RT-PCR法半定量Fas m RNA和FasLm RNA表达水平

1.2.1 总RNA提取 取上述样本放入1‰DEPC处理的研钵中充分研磨后,加入 1m l Trizol试剂(美国Invitrogen),按说明书提取组织的总RNA。在质量浓度为10 g/L的琼脂糖凝胶上电泳,检测RNA完整性。以 Pharmacia Biotech Gene QuantⅡ紫外分光光度计测量总RNA在260 nm和280 nm时的吸光度比值A 260/A 280。

1.2.2 逆转录 取1μl总RNA,采用逆转录试剂盒(美国Promega),应用PEK IN ELMER 480DNA扩增仪进行cDNA第一链的合成。

1.2.3 聚合酶链反应 引物由上海生工公司设计合成,FasmRNA 的引物序列为 5＇-GCAATGCTTCTCTCTGTGACCACTG-3＇(上游),5＇-GCTGTTGTGCTCGATCTCA TCG-3＇(下游),产物长度为347 bp;FasLm RNA 的 引物 序列 为 5＇-ATAGAGCTGTGGCTACCGGT-3＇(上游),5＇-CTCCAGAGATCAAAGCAGTTCC-3＇(下游),产物长度为285 bp;β-actin 为内参照 ,引物序列 为 5＇-TTGTA-ACCAACTGGGACGATATGG-3＇(上 游),5＇-GATCTTGATCTTCATGGTGCTAGG-3＇(下游),产物长度为760 bp。PCR反应总体积为25μl,反应条件为Fasm RNA;94℃预变性5 min;循环参数：94℃变性40 s,61℃退火1 min,72℃延伸1 min,共28个循环;最后72℃延伸 7 m in;FasLm RNA：94℃预变性5min;循环参数：94℃变性40 s,63℃退火1m in,72℃延伸1m in,共28个循环;最后 72 ℃延伸 7 m in;β-actin：94 ℃预变性 5 m in;循环参数：94℃变性40 s,55℃退火40 s,72℃延伸40 s,共 30个循环;最后72 ℃延伸7 min.取 5μl PCR扩增产物进行质量浓度为20 g/L琼脂糖凝胶(含0.5 mg/L溴乙锭)电泳,电压5 V/cm,在 WD-9403紫外线摄影仪上摄影记录。用TotalLab软件进行吸光度容积定量分析。

1.3 统计学处理 应用方差分析和q检验。

2 结 果

缺血半暗带组织Fasm RNA、FasLm RNA的表达水平：Ⅰ组FasmRNA、FasLm RNA均未见表达,Ⅱa及Ⅱb组表达水平明显增高,Ⅲa及Ⅲb表达水平明显下降(图 1、2),扩增片段分别为347 bp、285 bp、RT-PCR半定量光密度比值(Fas/β-actin m RNA 、FasL/β-actinm RA)见表 1 。

图1 各组FasmRNA RT-PCR产物电泳图

图2 各组FasLmRNA RT-PCR产物电泳图

表1 各组脑组织缺血半暗带皮质Fasm RNA、FasLmRNA 表达水平(±s,n=8)

表1 各组脑组织缺血半暗带皮质Fasm RNA、FasLmRNA 表达水平(±s,n=8)

注：与Ⅲa及Ⅱb组比较,*P＜0.01

组别 Fas/β-actin mRNA FasL/β-actin mRNAⅡa组 0.90±0.05 0.45±0.02Ⅱb组 0.94±0.06 0.51±0.03Ⅲa组 0.45±0.03* 0.22±0.03*Ⅲb组 0.40±0.06* 0.16±0.01*

3 讨 论

Fas又称Apo-1或CD95,是一个 45 kd的Ⅰ型膜蛋白,属于TNF和NGF受体超家族。Fas具有1个跨膜结构,C末端位于细胞外,具有3个富含半胱氨酸结构域;细胞内存在一个诱导细胞凋亡所必须的特殊结构——凋亡结构域[5,6]。Fas配体(FasL)是一个40 kd的Ⅱ型跨膜糖蛋白,属TNF家庭成员。成年哺乳动物正常大脑检测不到Fas基因表达信号,而脑缺血诱发Fas基因表达。本研究结果显示,大鼠脑缺血再灌注后 Fasm RNA和FasLmRNA的表达水平均明显增高,这表明脑缺血再灌注的确可诱导FasmRNA、FasLmRNA在脑中表达。Fas与活化细胞交联诱导凋亡的机制主要是细胞内酷氨酸和丝/苏氨酸的磷酸化。凋亡信号的转导是通过Fas与FasL结合,诱导神经鞘磷脂酶Smase的活化,分解SM生成神经酰胺(CM),CM通过膜结合性的丝/苏氨酸蛋白激酶等激活第二信使途径,使胞内钙离子浓度升高引发一系列的生化反应,从而诱导凋亡发生。脑缺血后细包凋亡发生的机制尚不完全清楚,既是凋亡相关基因表达的结果,又受其他许多内外因素调节。Fas参与脑缺血后凋亡的机制可能是缺血性脑损伤后Fas和FasL均表达,在原位直接导致细胞凋亡;表达Fas血细胞通过血-脑屏障与表达FasL的神经细胞相遇,或表达FasL的血细胞与表达Fas的神经细胞相遇,将造成神经细胞的死亡;可能其他细胞因子可以上调Fas的表达,促进细胞凋亡过程。总之,这其中的机制还有待于进一步研究。

巴曲酶(DF-521)是由生物合成的一种高纯度类凝血酶样物质,属于糖蛋白,其肽链由231个氨基酸组成,分子量36000,是目前比较公认的治疗缺血性脑血管病的药物之一,如降低纤维蛋白原含量、改善循环等,DF-521还具有减少缺血性脑血管病后的神经细胞坏死和凋亡数量、多层次多途径的神经保护作用[7,8]。巴曲酶能否通过抑制脑缺血再灌注后FasRNA和FasLm RNA表达来减少细胞坏死和凋亡而起到脑保护作用呢?本试验结果显示Ⅱa及Ⅱb组表达水平明显增高,Ⅲa及Ⅲb组表达水平明显下降,并且两组相比有显著差异(P＜0.01)。因此,本研究认为巴曲酶对Fasm RNA和FasLm RNA表达有抑制作用,也就是说它有可能通过抑制Fasm RNA和FasLm RNA表达而起到脑保护作用,这其中的详细作用机制还不十分清楚,有待进一步研究。

1 魏家臣.Fas/FasL介导凋亡细胞机制及其病理生理意义.国外医学-外科学分册,2003,1(3)：21-23.

2 刘 涌,胡明均,何国厚.Fas/FasL的高表达在缺血性脑损伤中的意义.中国临床康复,2003,7(31)：4184-4185.

3 Longa EZ,Weinstein PN,Carlson S,et el.Reversiblem iddle cerebralartery occlusionW ithout craniotomy in rats.Stroke,1989,20(2)：84-91.

4 范红杰,于维东,欧阳巍.栓线法建立大脑中动脉局灶缺血实验模型对再灌注损伤的评价意义.中国临床康复,2003,7(16)：2292-2293.

5 m rtin A,H err I,Jerem ias I,et al.CD 95 ligand(Fas-L/APO-IL)and TNF-related apoptosis-inducing ligand mediate is-chem ia-induced apoptosis in neu rons.JNeu rosci,1999,19(4)：3809-3817.

6 于新路,王 和,张 波.大鼠肾缺血/再灌注损伤不同时相Fas,FasL蛋白表达及意义.中国临床康复,2003,7(2)：350-351.

7 苏志强,刘亢丁,饶明俐.不同剂量巴曲酶对大鼠局灶性脑缺血再灌流后细胞凋亡的影响.中风与神经疾病杂志,2001,18(1)：10-11.

8 吴惠民.巴曲酶和奥扎格雷钠治疗脑血栓.中国实用神经疾病杂志,2007,10(9)：78-79.