与番茄枯萎病抗病基因I-1连锁的AFLP和SSR分子标记

李发玲, 李景富, 康立功, 张 贺, 许向阳

(东北农业大学园艺系,哈尔滨 150030)

番茄枯萎病是番茄生产特别是保护地栽培的重要病害之一,是番茄生产中一个重要的限制性因素。由于枯萎病是土传性病害,其病菌抗逆性强,药剂防治效果不理想。因此,选育和利用抗病品种是番茄枯萎病的主要防治方法。

早在1940年,人们就发现番茄枯萎病病菌有生理小种分化,并存在2个生理小种[1-3]。枯萎病是由显性单基因控制[4]。通过F.o.lycopersici和栽培番茄的相互作用,目前已发现有3个不同的抗病基因[3-7],分别为 I-1、I-2、I-3。抗生理小种1的基因为I-1;抗生理小种2的基因为I-2;对生理小种1和生理小种2都具有抗性的基因为 I-3。目前,对I-2、I-3基因的研究较深入,I-2已进行到克隆阶段[8],I-3基因已被 RFLP[9]、AFLP[10]、SCAR[11]、CAPS[12]等技术精确作图。但对I-1基因的研究不够深入,Bohn[13],Paddock[14]把 I-1基因定位到第11条染色体上,而Sarfatti[15]把I-1基因定位到第7条染色体上。

在分子标记技术中,AFLP技术和SSR技术被广泛应用于基因的分子标记、定位、遗传图谱构建等方面。与其他技术相比,AFLP技术多态性丰富、DNA用量少检测效率高、不受环境影响、无复等位效应、带纹丰富、无需预知基因组的序列信息;SSR技术多态性高、重复性好、具有共显性、操作简单。本研究利用AFLP技术和SSR技术,筛选与番茄枯萎病抗病基因I-1连锁的AFLP标记和SSR标记,为加快番茄抗枯萎病育种、丰富番茄遗传图谱和番茄分子标记辅助育种提供帮助。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 番茄材料

本试验以抗枯萎病品种‘05045'(含I-1基因)为母本,感病品种‘051451'为父本,配制杂交组合获得F1代,通过在海南岛加代获得F2代。上述材料均由东北农业大学园艺系番茄课题组提供。

1.1.2 番茄枯萎病菌

番茄枯萎病菌属生理小种1,由东北农业大学园艺系番茄课题组提供。

1.1.3 试剂

试验所用的AFLP接头、AFLP引物、SSR引物均由上海生工生物工程公司合成,RNase、Taq聚合酶、MseI、EcoRI、T4连接酶均为美国 MBI公司产品,dNTP为 TaKaRa公司产品,其他试剂均为国产分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 番茄枯萎病抗性鉴定

把在PSA培养基上培养了7 d的番茄枯萎病病菌制备成分生孢子含量为107个/mL的菌悬液,采用浸根法结合注射法,在F2代群体1～2片真叶时接种,遮光处理1周,25 d后调查并记录发病情况。将F2代群体分为抗病和感病两类。

1.2.2 叶片总DNA的提取

在发病高峰期分别取抗病和感病各20株幼嫩叶片,采用改良的CTAB法[16]提取叶片DNA,用于构建抗感池。再取各F2单株幼嫩叶片,提取DNA,用于选择性扩增。用0.8%的琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测DNA质量和浓度。

1.2.3 AFLP标记

AFLP标记参照 Vos的方法[17]。酶切采用EcoRⅠ/MseⅠ双酶切;预扩增引物采用 E00和M00;选择性扩增采用E引物和M引物组合的870对引物。PCR产物用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,80W恒功率电泳2h,银染后观察。

1.2.4 SSR标记

SSR标记参照优化的SSR体系[18]。采用319对引物。PCR产物用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,75W恒功率电泳1h,银染后观察。

1.2.5 数据统计及连锁距离分析

利用χ2检验分析AFLP、SSR多态性标记与抗病和感病植株的性状分离情况。应用Map Maker 3.0软件计算连锁遗传距离,临界LOD值取3.0。

2 结果与分析

2.1 抗病性鉴定结果

对F2代群体的348个单株进行了番茄枯萎病抗病性鉴定,其中抗病259株,感病89株。χ2=0.113,符合显性单基因的遗传规律。

2.2 AFLP标记

2.2.1 引物筛选

用父母本‘051451'和‘05045'对870对选择性扩增引物进行筛选。筛出差异引物392对,筛出差异性较好的引物51对。在抗感池中对筛选出的51对多态性较好的引物进行复选,筛出24对差异性多和多态性好的引物。(见表1)

表1 筛出的24对差异性好的AFLP特异引物

2.2.2 F2单株PCR扩增

利用筛选出的24条引物对348株F2代群体进行扩增。利用MapMaker3.0软件进行连锁分析,结果表明：E41M60-D(280 bp)、E41M62-C(310 bp)、E86M36-B(420 bp)和E32M44-E(120 bp),与抗病基因I-1的连锁遗传距离分别为4.7、5.3、8.9、11.5cM。其中E41M60-D见图1,其余图片略。

2.2 SSR标记

2.2.1 引物筛选

用父母本‘051451'和‘05045'对 319对 SSR引物进行筛选。筛出父母间差异好的引物25对。然后在基因池中进行复选,筛出16对差异显著且稳定的引物(见表2)。

图1 引物E41M60在部分F2单株中的扩增结果

表2 筛出的16对差异性好的SSR特异引物

2.2.2 F2单株PCR扩增

用筛选出的16条引物对348株F2代群体进行扩增。利用MapMaker 3.0软件进行连锁分析,结果表明：SSR108(如图 2)、SSR276(图略)与抗病基因I-1的连锁遗传距离分别为6.1、9.3cM。

图2 引物SSR108在部分F2单株中的扩增结果

3 讨论

番茄枯萎病是土传性病害,病菌长年累积发病才充分,而在试验条件下充分发病是一大难题。本研究采用浸根法结合注射法,在浸根20 min后,再注入0.5 mL的菌悬液,以保证充分发病。将两种常规的方法结合起来,使鉴定效率更高。

本研究所得到的 AFLP标记 E41M60-D与抗病基因I-1的连锁遗传距离为4.7cM,为该基因定位和克隆、在番茄苗期开展抗性鉴定及番茄枯萎病的遗传学研究奠定了基础。番茄枯萎病病菌生理小种1在我国是优势小种,因此本研究所得到的标记对开展番茄枯萎病抗病育种具有重要实践意义。但由于亲本之间亲缘关系较近、某些DNA的降解导致聚丙烯酰胺凝胶电泳银染后条带不清晰、不同批号的无水碳酸钠对染色深浅的影响从而影响数据统计等误差,影响了遗传距离的准确性。因此,下一步可以利用新一代的操作更简单、更准确的分子标记技术寻找更加紧密连锁的标记。

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