疏血通注射液对大鼠随意型皮瓣存活的影响

林丁盛 张义鹏 郑鑫 李志杰

随意型皮瓣因取材方便和灵活而广泛应用于临 床组织缺损的修复和重建。但随意型皮瓣的长宽比一般不超过2∶1。一旦超出该长宽比，皮瓣远端容易发生缺血坏死，这极大地限制了它在临床上的应用。如果在增加随意型皮瓣长宽比例的同时改善皮瓣微循环、增加血运，可保证较高的成活率，对提高临床随意型皮瓣的应用范围有重要意义。疏血通注射液具有抗凝、溶栓、促纤溶、抗血小板聚集、细胞保护等作用。我们研究疏血通注射液对大鼠随意型皮瓣成活的影响，并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验试剂及动物

疏血通注射液(批号100403-1)购自牡丹江友搏药业有限责任公司，小鼠抗大鼠血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)抗体购自美国Santa Cruz公司，山羊抗小鼠二抗购自北京中杉金桥公司。健康的Sprague Dawley大鼠24只(由温州医学院实验动物中心提供)，雌雄不拘，体质量150～200 g，2～3个月龄。

1.2 模型制备及分组

将大鼠随机分为疏血通实验组和生理盐水对照组，每组12只。10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉;将动物俯卧位固定，脱毛、碘伏消毒、铺巾，采用改良McFarlane皮瓣制作方法［1］，以大鼠背部两髂嵴连线为蒂，在背部正中设计一长9 cm、宽3 cm矩形随意型皮瓣，沿设计线切开皮肤、皮下组织达深筋膜浅层，保留真皮下毛细血管网，于深筋膜浅层表面分离皮下组织，遇到轴型血管即以4-0丝线结扎。皮瓣完全掀起后，彻底止血，立即用4-0缝线距皮缘0.5 mm、间距1 mm原位间断缝合。切口周围聚维酮碘消毒后涂抹金霉素软膏，两组在手术后立即经腹腔注射药物。实验组腹腔内注射疏血通注射液1.5 mL·kg－1· d－1，对照组腹腔内注射灭菌生理盐水 1.5 mL·kg－1· d－1，均单笼饲养。为减少手术操作带来的误差，所有手术由同一人完成。

1.3 标本处理

注射后第7天将大鼠处死，将皮瓣3等分(见图1)，分别在皮瓣近蒂部(Ⅰ区)、中部(Ⅱ区)和远端(Ⅲ区)切取组织标本［2］。用10%甲醛溶液固定，常规脱水包埋切片行HE染色，光镜观察。

采用Elivison二步法进行免疫组化检测VEGF表达。石蜡切片置于60℃烘箱中，烘片60 min。在微波炉里加热0.01 mol枸橼酸钠缓冲溶液(pH 6.0)至沸腾后将组织防脱片放入，中高火加热7 min;取出微波盒流水自然冷却。从缓冲液中取出玻片，蒸馏水冲洗，PBS冲洗，每张切片加1滴3%过氧化氢溶液，室温下孵育10 min，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗，滴加正常山羊血清封闭液，室温20 min，滴加一抗50 μL，4℃过夜。37℃复温45 min，PBS 冲洗，滴加二抗 50 μL，37 ℃ 孵育 1 h，PBS冲洗，DAB显色5～10 min，在显微镜下掌握染色程度，PBS冲洗，苏木精复染1 min，蒸馏水浸泡，脱水和透明，封片和镜检。

图1 大鼠背部随意型皮瓣设计及分区示意图

1.4 皮瓣存活面积比的检测

术后1～7 d，每天肉眼观察皮瓣存活状况(颜色、质地、坏死面积等)并记录。术后第7天，各组大鼠在麻醉状态下用透明纸覆盖，准确测量皮瓣成活或坏死面积，并剪成成活或坏死两部分，分别以电子秤测质量。按以下公式计算皮瓣存活面积比:皮瓣存活面积比=皮瓣存活面积玻璃纸质量÷皮瓣总表面积玻璃纸质量×100%。皮瓣坏死标准:皮瓣颜色发黑，组织回缩、弹性差，质地坚硬，切割组织不出血;病理表现为组织崩解、细胞核消失、炎症细胞广泛浸润、有局灶出血。

1.5 皮瓣组织学检测

于皮瓣术后第7天取皮瓣标本，OCT包埋剂包埋，液氮中保存，冰冻切片厚度为5 mm，进行HE染色。100倍光镜下观察肉芽组织层厚度、组织水肿、坏死、炎症细胞浸润等情况，并进行微血管密度检测。计数方法为:每组1张切片，每张切片在中央区和周边区随机选取5个高倍(放大200倍)视野，血管计数后取其平均数。每高倍镜野为0.305 mm2，计算出单位面积微血管数目(个/mm2)作为评价微血管密度的指标。

1.6 VEGF 检测

在光学显微镜下观察经免疫组织化学Elivison二步法检测VEGF的组织切片，先用低倍镜寻找阳性表达密集区域，然后改用高倍镜观察。每张片子选取5个高倍(放大400倍)视野，用配套的图像采集系统拍摄保存。拍摄过程中，白平衡、光圈、快门时间等参数设定保持一致。将保存的图片导入Image-Pro Plus v 6.0软件，选择需要分析的指标“累积吸光度IA值”，读取IA数值进行测量，作为评价VEGF表达的指标。

1.7 统计学处理

数据均采用均数±标准差表示。用SPSS 16.0统计软件进行统计学分析。GraphPad.Prism 5.0制图，检测结果分析采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组皮瓣大体形态学比较

术后第1天，两组皮瓣均出现不同程度的肿胀，Ⅲ区呈暗紫色，但无明显坏死;术后第3天，实验组、对照组皮瓣Ⅱ区和Ⅲ区出现局灶状、小片状坏死，坏死部分多呈红褐色，有淤血;术后第7天两组皮瓣Ⅱ区和Ⅲ区坏死部分均趋于融合，有黑色痂壳出现，手感变硬，皮瓣分界基本稳定(见图2)。

图2 两组大鼠随意型皮瓣术后大体形态观察

2.2 两组皮瓣存活面积比比较

实验组皮瓣的存活面积比为(72.52±2.23)%，对照组皮瓣存活面积比为(50.36±2.37)%，两组皮瓣的存活面积比差异有统计学意义(t=3.506×10－5，P ＜0.01)。

2.3 两组皮瓣组织学检测

两组皮瓣术后第7天的Ⅲ区组织学形态相似，均表现为急性炎症细胞浸润，90%肉膜层表现为肌纤维变性坏死。实验组Ⅰ区存活情况与对照组相比，组织水肿、血管扩张、炎症细胞浸润较轻(见图3)。实验组新生血管计数Ⅰ区(34.71 ±6.37)个/mm2，Ⅱ区(27.42±4.21)个/mm2;对照组新生血管计数Ⅰ区(32.71 ±5.36)个/mm2，Ⅱ区(17.45 ±5.43)个/mm2;两组Ⅲ区皮瓣均坏死。两组皮瓣Ⅰ区微血管密度差别无统计学意义(t=0.269，P ＞0.05)，Ⅱ区微血管密度实验组大于对照组(t=3.800 ×10－3，P ＜0.05)。

图3 两组Ⅱ区皮瓣组织学观察(HE染色)

2.4 两组皮瓣VEGF检测结果比较

两组免疫组织化学染色结果见图4。VEGF的IA值实验组为4731.24 ±448.99，对照组为2466.01 ±801.67，差异有统计学意义(t=4.320 ×10－3，P ＜0.01)。

图4 两组血管内皮生长因子表达(免疫组织化学 ×400)

3 讨论

随意型皮瓣是临床上修复创面、重建功能、改善外形常用的皮瓣，但在临床超过一定长宽比其远端易发生缺血坏死，这可能与血供不足、缺血再灌注损伤以及细胞凋亡相关因子的参与等有直接关系［3-4］。

疏血通注射液是一种行气活血中成药，其主要成分是水蛭和地龙［5-6］。其中水蛭最主要的提取物是水蛭素。水蛭素是目前发现作用最强的凝血酶特异性抑制剂，具有很强的抗凝作用。它通过与凝血酶直接结合而发挥抗凝作用，同时抑制凝血酶诱导的血小板激活，具有明显的抑制血小板聚集作用;另外水蛭素有直接溶解血栓和抗血栓形成作用，它不仅可以与血浆中游离的凝血酶结合，还可中和与纤维蛋白结合的凝血酶，用于治疗各种原因引起的血栓［7］。研究表明，局部运用水蛭素对皮瓣静脉淤血有明显的防治作用［8-9］。疏血通注射液的另外一种成分是地龙，其提取物中含有蚓激酶，也是一种高效抗凝、促纤溶作用物质。在体外具有很强的纤溶活性，在体内、体外能够促进组织纤溶酶原激活物的表达，具有促进血栓溶解、恢复血流灌注，并防止血栓再次形成的作用，对于改善血液循环有一定的意义［10］。

缺血组织中组织因子的水平增高［3］，组织因子与Ⅶ因子结合是血液凝固的一条主要途径，阻止两者的结合可以抑制血栓形成，增加皮瓣血供，从而提高皮瓣存活率。全身应用疏血通注射液能有效降低缺血皮瓣的坏死，并有利于早期皮瓣的存活，可能与上述物质相互作用，防止血栓形成，改善局部皮瓣血液循环有关。在本文资料中，实验组皮瓣存活面积明显大于对照组证实了疏血通注射液在改善局部皮瓣血液循环中的作用。

中医学认为“气血相关”，“行气通脉”，“补气活血”，“脉者血之府也”，因此具有行气活血作用的中药可能具有促血管生成作用，这为中药促血管生成奠定了理论基础。本实验结果证实，在皮瓣坏死与存活并存的Ⅱ区，实验组出现大量的新生血管，血管密度增大。有研究表明:VEGF直接作用于血管内皮细胞促其增殖分化，促进皮瓣的毛细血管新生，提高再生血管的数量和质量，加快皮瓣与受区及皮瓣与切缘之间的血运重建，改善皮瓣远端微循环，从而促进皮瓣成活［11］。疏血通注射液可以促进糖尿病后肢缺血大鼠腓肠肌中VEGF表达增加［12］，以及缺血脑组织中VEGF的表达［13］，从而促进毛细血管生成，发挥保护作用。本研究也观察到实验组皮瓣VEGF表达较对照组增多，这提示疏血通注射液可能作用于缺血皮瓣，通过增加VEGF等血管生长因子的表达以增加皮瓣局部新生血管增生、提高血管密度，最终促进皮瓣的存活。

应用疏血通注射液能有效刺激新生血管增生，降低炎症反应，减少缺血皮瓣的坏死，并有利于提高超长随意型皮瓣的成活，有望解决皮瓣远端易坏死的临床问题，但具体的作用机制还需进一步探讨。

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