神经节苷脂联合尼莫地平对脑缺血半暗带细胞凋亡及凋亡蛋白Bcl-2/Bax的影响

杨慧芬,潘妍婷

1 材料与方法

1.1 动物与分组 成年健康雄性SD大鼠36只,体重250 g～280 g,清洁级,由北京大学医学部实验动物中心提供。应用线栓法经右侧颈总动脉插线建立右侧大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)再灌注模型,随机分为模型组(n=16):缺血 2 h 再灌注 6 h、12 h、24 h、72 h 组,即刻腹腔注射等量的生理盐水;药物治疗组(n=16):在模型组基础上给予腹腔注射神经节苷脂GM 1(申捷)3.2mg/kg、尼莫地平1.6 mg/kg)。假手术组(n=4):假手术组除不插线外,其余步骤同模型组。

1.2 标本采集 模型组及治疗组动物在规定时间取材。分别于缺血2 h再灌注6 h、12 h、24 h、72 h取材,假手术组于手术后1 d取材。大鼠在10%水合氯醛(300 mg/kg)麻醉下,经左心室插管至升主动脉,依次灌入生理盐水200 mL、4%的多聚甲醛300 mL,灌注完毕后,断头取脑,自额极至枕叶分为5等份,取中间份石蜡包埋。制备厚5μ m的连续切片。

1.3 免疫组化染色 对各个组不同时间点脑组织中细胞凋亡蛋白 Bcl-2、Bax进行染色。Bcl-2、Bax蛋白检测Ⅰ抗(兔抗大鼠 Bcl-2、BaxIgG),Ⅱ抗(生物素标记山羊抗兔IgG)。染色步骤按照免疫组化试剂盒说明进行。Bcl-2、Bax均以胞浆出现棕黄色染色为阳性。免疫染色阴性对照采用PBS缓冲液代替Ⅰ抗。

1.4 T UNEL细胞凋亡检测 将石蜡包埋标本行冠状切片,厚5 μ m,按 TUNEL试剂盒说明书进行操作。光镜下阳性细胞核呈棕黄色。

2 结 果

2.1 凋亡相关蛋白表达 假手术组Bcl-2、Bax表达很弱。模型组缺血侧皮质区随再灌注时间不同,Bcl-2、Bax表达不同。Bcl-2随着再灌注时间的延长,12 h阳性细胞数达高峰;Bax阳性细胞表达24 h达高峰。药物治疗组缺血2 h再灌注12 h Bcl-2表达明显增多,阳性细胞计数明显高于模型组;而Bax表达:24 h阳性细胞计数明显低于模型组。再灌注12 h Bcl-2/Bax比值增高。详见表1、表2。

表1 缺血区皮层凋亡细胞及Bcl-2、Bax蛋白表达动态变化(±s)

表1 缺血区皮层凋亡细胞及Bcl-2、Bax蛋白表达动态变化(±s)

组别 n 凋亡细胞计数 Bcl-2 Bax假手术组 4 10.15±2.25 13.20±2.23 11.56±2.28模型组 6 h组 4 35.23±3.34 19.87±2.34 35.23±3.34 12 h组 4 48.46±2.25 27.45±3.321) 48.46±2.25 24 h组 4 57.62±2.791) 22.46±2.49 5.63±2.711)72 h组 4 52.32±3.87 17.22±2.13 49.23±2.72药物治疗组 6 h组 4 31.03±2.44 49.27±2.82 31.23±3.52 12 h组 4 40.13±2.62 42.23±3.52 36.78±2.66 24 h组 4 48.34±2.39 37.23±3.642) 40.75±2.332)72 h组 4 43.34±3.38 30.33±2.58 34.14±2.58与假手术组比较,1)P＜0.01;与模型组比较,2)P＜0.05

表2 缺血再灌注不同时间Bcl-2/Bax比较(±s)

表2 缺血再灌注不同时间Bcl-2/Bax比较(±s)

组别 n 6 h 12 h 24 h 24 h药物治疗组 16 0.933±0.125 1.543±0.2361) 1.122±0.1121) 0.884±0.1341)模型组 16 0.911±0.126 1.211±0.113 0.786±0.325 0.512±0.137假手术组 4 0.921±0.132 1.033±0.224 0.968±0.313 0.911±0.248与模型组比较,1)P＜0.05

2.2 T UNEL表达 阳性细胞主要位于缺血周围区,缺血中心区未见阳性细胞表达。假手术组有弱表达,胞核染色阳性,细胞体积较小且收缩变形。模型组缺血2 h再灌注24 h阳性细胞表达达高峰;药物治疗组缺血半暗带区TUNEL阳性细胞表达,随再灌注时间延长,24 h达高峰,但少于模型组。

3 讨 论

外源性神经节苷脂进入血液后,与脂蛋白结合并由其运送,可通过血脑屏障嵌合于神经细胞胞浆膜中,对神经元细胞分化、生长、轴浆转运和再生起着重要作用,对神经元的损害有明显的保护作用[1]。而尼莫地平为二氢吡啶类钙通道阻滞剂,减少Ca2+内流,提高缺血区局部脑血流量。氧自由基的产生可诱导细胞发生凋亡[2],尼莫地平可降低脑缺血再灌注后脑组织中NO含量[3],从而减少了NO介导的神经损伤作用,即减少了对Bcl-2表达的损伤,从而抑制了神经细胞凋亡,减轻缺血性损伤,起到神经保护作用。本实验观察了腹腔注射神经节苷脂GM1和尼莫地平后,发现缺血侧皮层凋亡细胞数显著减少,与模型组对比,有统计学意义。药物治疗干预后,对神经细胞可能有保护作用。

细胞凋亡的发生取决于促凋亡蛋白和抑凋亡蛋白浓度。Bcl-2和Bax是Bcl-2家族中两类典型的抑凋亡蛋白和促凋亡蛋白,发生凋亡时,Bcl-2家族蛋白通过成员间的异二聚化、磷酸化、蛋白水解等方式,最终定位于线粒体膜引起膜通透性的改变[4],并和Bax通过形成异源二聚体时,实现Bcl-2抑制细胞凋亡的功能。Bcl-2的这种神经保护作用主要依赖于他对凋亡的抑制。本组试验,假手术组皮层Bcl-2和Bax只有少量表达,而模型组缺血侧皮层Bcl-2和 Bax表达明显增多,Bcl-2蛋白在缺血早期表达明显上调,至再灌注12 h达高峰,此时,Bcl-2/Bax比值达到高峰,以后逐渐下降,表明缺血再灌注最初阶段,Bcl-2蛋白发挥着细胞保护作用,但随着时间的延续,凋亡级联反应出现,细胞受损加重,Bcl-2蛋白降解增加,表达逐渐下降;促凋亡蛋白Bax表达在缺血在缺血早期表达逐渐上调,24 h达高峰。当Bax形成同源二聚体时诱导细胞凋亡,Bax通过并从胞浆向线粒体转位[4]。其时间与空间的分布与T UNEL阳性神经元一致。干预治疗后脑缺血再灌注6 h～24 h,对大鼠脑组织缺血侧皮层Bcl-2的促表达作用明显增强,Bax表达明显减少,至再灌注12 h Bcl-2/Bax比值达高峰,提示干预治疗后抗凋亡的脑保护作用不仅与上调Bcl-2表达有关,同时还与下调Bax表达有关。

神经节苷脂GM1联合尼莫地平干预治疗对大鼠脑缺血再灌注损伤后缺血侧Bcl-2/Bax比值皮层凋亡相关蛋白Bcl-2上调、Bax蛋白下调,对缺血半暗带细胞抗凋亡作用,可能成为挽救濒死细胞最直接有效的方法,起到脑保护作用。

[1]Xu XH,Zhang SM,Yan WM,et al.Development of cerebral infarction,apoptotic cell death and expression of X-chromosome-linked inhibitor of apoptosis protein following focal cerebcal ischemia in rats[J].Life Sci,2006,78:704-708.

[2]Harper N,Hughes M,Farlane M,et al.Fas-associated death domain protein and caspase-8 are not recruited to the tumor necrosis factor receptor 1 signaling complex during tumo r necrosis factor induced apoptosis[J].J Biol Chem,2003,278(28):25535-25543.

[3]Roset R,Ortet L,Gomez G.Role of Bcl-2 family members on apoptosis:What we have leaened from knock-out mice[J].Front Biosci,2007,12(20):4722-4727.

[4]Lalier L,Cartron PF,juin P,et al.Bax activation and mitochondrial insertion during apoptosis[J].Apoptosis,2007,12(5):887-894.