环氧化酶-2 765G/C基因多态性对原发性肝癌易感性的研究

宋 霞 程世红 刘 纯 刘亚丽 孙晶晶

肝细胞肝癌(hepatiocellular carcinoma，HCC，以下简称肝癌)是世界上也是我国最常见的恶性肿瘤之一，全世界每年新发病56.4万例，且有上升的趋势[1]。近年来，环氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)作为1个非常重要的肿瘤相关基因，得到了广泛的重视。迄今为止，已发现COX-2的基因多态性(SNP)与食管癌[2]、口腔鳞状细胞癌[3]、结肠癌[4]、乳腺癌[5]等肿瘤的发病风险相关，在肝癌组织中也发现了COX-2的异常表达[6]。本文对COX-2 启动子区域的-765 G/C基因多态性进行分析，旨在探讨COX-2 启动子区域-765G/C基因多态性与肝癌发生易感性的关系。

1 材料与方法

1.1 资料

肝癌组300例，男性204例，女性96例，年龄42～74岁，平均59.13岁。健康对照组300例，男性192例，女性108例，年龄24～78岁，平均45.77岁。肝癌组选自2000年1月～2010年3月兰州大学第一医院普外二科、肿瘤科收治的、经过血清学、临床检验、影像学、病理学检查确诊的患者，符合世界卫生组织(WHO)关于肝癌的命名和诊断标准。健康对照组选自兰州大学第一医院体检中心。同地区、排除病毒性肝炎、肿瘤和消化系统疾病的健康人群。两组均为甘肃省常住人口(居住超过15年)，应用统一调查表的形式进行调查，包括年龄、性别、饮酒史和肝癌家族史，在纳入研究前采集流行病学资料，每位患者均被告知研究细则，并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 外周血基因组DNA的提取 清晨空腹采集外周静脉血4 ml，k2-EDTA抗凝，-80℃冻存备用。统一采用常规蛋白酶K、酚/氯仿法抽提外周血基因组DNA。

1.2.2 COX-2基因多态性检测 采用多聚酶链反应—限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)法，对COX-2-765G/C位点基因分型。引物参考文献[7]设计。上游引物：F 5’ -ATT CTG GCC ATC GCC GCT TC-3’；下游引物： R 5’ -CTC CTT GTT TCT TGG AAA GAG ACG-3’ (由上海基康生物有限公司合成)。反应体系为50 μl，包括10×PCR buffer 5 μl，Mg2+3 μl，10 mmol/ L dNTPs 5 μl，引物1、2各2 μl，DNA模板1 μl，DNA聚合酶 1 μl，体积不足部分用双蒸水补足。PCR反应条件：95 ℃ 预变性3 min，95℃ 变性30 s，59℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，循环35次，最后72 ℃ 延伸10 min。用未加DNA模板的去离子水反应体系作为阴性对照。PCR产物进行Bsh 1236 I 限制性内切酶酶切分型(Fermentas公司)，总反应体系20 μl，包括PCR产物10 μl，10×PCR buffer R 2 μl，Bsh 1236 Ⅰ限制性内切酶2 μl，其余部分用三蒸水补齐，37℃ 水浴14 h，3% 琼脂糖凝胶(溴化乙锭染色)，100 V电泳40 min，电泳结束后用紫外反射透射分析仪对凝胶进行观察，照相。将PCR产物及酶切产物与DNA片段长度标准物(20 bp)比较以鉴定基因型。

1.3 统计学处理

应用SPSS17.0软件对数据进行处理，用Hardy-Weinberg 平衡检验样本的群体代表性，用χ2检验比较两组基因型和等位基因频率差异，以非条件Logistic 回归计算相对风险度(odds ratio，OR)及其95%可信区间(confidence interval，CI)，评价各基因型与肝癌发病风险的关系，并以年龄、性别、饮酒史和家族史对等位基因频率进行分层分析。

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg 平衡检验

COX-2 -765 G/C基因型分布在健康对照组符合Hardy-Weinberg 平衡(P>0.05)，具有群体代表性。

2.2 一般特性

肝癌组患者年龄42～74岁，中位年龄58岁；健康对照组年龄24～78岁，中位年龄51岁。两组患者年龄、性别构成差异无统计学意义(P>0.05)，有饮酒史者肝癌组分布率高于健康对照组(66.3% vs 57.7%,P=0.029)。有肝癌家族史者肝癌组分布率高于健康对照组(16.3% vs 0.87%,P=0.005)，见表1。

表1 肝癌组与健康对照组的临床特征(例，%)

2.3 COX-2 -765 G /C 多态性分析

COX-2 -765G/C 有G/G、G/C、和C/C 3种基因型。PCR 扩增产物片段长度为 157 bp，包含 Bsh 1236 I 酶切片段。G/G基因型(野生型) 的扩增产物可被完全切断，电泳可见134 bp 片段(23 bp 片段在琼脂糖凝胶中不显影)；G/C 基因型为杂合子，可见 157 bp 和134 bp 2种片段，C/C 基因型(突变纯合子)不能被酶切断，仅见157 bp 1种片段。基因分型实验在双盲状态下进行，采用单纯随机抽样法，对5%的样品进行重复基因型检测，获得一致结果(图 1) 。

图1 COX-2 -765G /C 多态性PCR-RFLP检测结果

M为Marker;1为PCR-RFLP扩增产物;2为G/G基因型;3为G/C基因型;4为C/C基因型

2.4 COX-2 -765G/C在肝癌组与健康对照组的基因频率及等位基因频率分布比较

COX-2-765 G/C多态性位点3种基因型的分布率及与肝癌的发病风险关系见表2。与COX-2 -765G/G纯合子相比，单独携带COX-2 -765G/C或携带COX-2 -765C/C纯合子基因型的个体在肝癌组和健康对照组的分布有统计学差异(G/C型：OR=2.119，95%CI：1.366～3.289；C/C型：OR=5.852，95%CI：1.269～26.990)。将COX-2 -765 G/C和C/C基因型合并后与COX-2 -765 G/G基因型进行比较，肝癌组和健康对照组比较有统计学差异(OR=1.311，95%CI：1.511～3.533)。可见，携带COX-2 -765*C基因型的个体比携带COX-2 -765G/G基因型的个体对肝癌更具有易感性，相同环境条件下，携带COX-2 -765*C基因型的个体患肝癌的风险增加。

2.5 COX-2 -765 G/C多态性与肝癌发生的相关性

依据年龄、性别、饮酒史和家族史几个方面，对两组COX-2 -765 G/C等位基因频率进行分层分析(表3)，并将G/C和C/C 2种基因型合并后与G/G基因型进行比较。结果显示：在年龄、性别的分层分析中，基因型在肝癌组和健康对照组的分布无差异。在饮酒史分层分析中，携带COX-2-765*C基因型的个体患原发性肝癌的风险是携带COX-2-765G/G基因型的3.434倍(OR=3.434；95%CI：1.926～6.137)。在有肝癌家族史的人群中，携带COX-2-765*C基因型的个体患原发性肝癌的风险是携带COX-2 -765G/G基因型的4.55倍(OR=4.550；95%CI：1.612～12.845)。

表2 COX-2-765 G/C基因型在肝癌组和对照组的分布情况(例，%)

表3 COX-2-765G/C基因型与肝癌发病风险相关性的分层分析(例)

3 讨论

环氧化合酶(cyclooxygenase,COX)是花生四烯酸合成前列腺素的关键限速酶，至少有2种同种异构体，即COX-1和COX-2。COX-1是结构酶，定位于内质网，在大多数组织细胞中恒长表达。COX-2是诱导酶，在正常生理状态下的大多数组织中几乎不表达，但是其可以被生长因子、细胞因子、血管作用多肽以及丝分裂素等诱导表达。

研究发现COX-2基因多态性与胃癌[2]、乳腺癌[5]、结直肠癌[4]等的易感性相关。在肝癌组织中也发现了COX-2的异常表达[6]，COX-2在所有的肝癌组织中都表达，并且在高分化的肝癌组织中的表达高于低分化的肝癌组织，提示COX-2可能参与到了肝癌发生的早期事件中[8]。

本研究首次对COX-2 -765 G/C 基因多态性与肝癌易感性进行研究。结果表明：COX-2*C基因型的个体在肝癌组明显高于健康对照组，提示COX-2 -765*C基因型的个体对肝癌更具有易感性，相同环境条件下，COX-2 -765*C基因型的个体患肝癌的风险增加。同时依据年龄、性别、饮酒史和家族史对COX-2 -765 G/C等位基因频率进行分层分析，发现：有饮酒史或者家族史的COX-2-765*C基因型的个体对肝癌更具有易感性，提示COX-2-765*C基因型可能与饮酒史或者家族史具有协同的作用。然而，目前我们还不能解释清楚COX-2-765*C基因型增加肝癌易感性的原因，可能是COX-2-765 G/C影响了COX-2的转录活性。COX-2的表达调控主要是在转录水平上，其中启动子及其活性对于转录的调控具有重要的作用。COX-2的5’端有TATA盒、CAAT增强子结合蛋白反应元件、CER(c AMP responsive element)反应元件、AP-2(activator protein-2)结合位点，以及NF-κB的结合位点[9]。当细胞受到生长因子、脂多糖、癌基因(如ras、KRAS)等的刺激，经过一系列信号转导作用于COX-2 5’端的调控序列，促进COX-2转录，进而诱导COX-2的表达。在肿瘤中，过度的表达COX-2会导致前列腺素(prostaglandin，PG)水平增高，PG可以通过促进肿瘤新生血管生成、抑制肿瘤细胞凋亡、刺激肿瘤细胞生长、增强肿瘤细胞侵袭力等多种机制诱发肿瘤的形成[8]。

但是，还有研究表明不同肿瘤类型中COX-2的表达不是完全相同的，在一些地域，一些肿瘤发生发展的过程中，COX-2的过表达会抑制肿瘤细胞的生长[10]。Sitarz等对荷兰人群研究发现与常见胃癌的COX-2过表达明显不同，早期胃癌中COX-2低表达，并且在早期胃癌、常见胃癌以及残胃癌中COX-2 -765*C 基因的频率低于健康对照组[11]。Melchiorre Cervello等发现COX-2在所有的肝癌组织中都表达，并且在高分化肝癌组织中的表达高于低分化肝癌组织[8]。其可能的原因是等位基因随着不同种族和地域而不同，或者是与选取的样本数量有关。

在全世界范围内，我国属于肝癌的高发国家之一。本研究发现COX-2 -765 G/C的C基因型增加肝癌易感性。然而，本研究仅仅是基于血清DNA水平的粗略研究，还有待于进一步的深入和细化，同时值得注意的是，由于样本量有限，本研究只能视为初步研究，有关的结论有必要进一步扩大样本验证。

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