天一圆蓝瘟毒康对家兔细胞免疫功能的影响

逯艳云,王芳,李雪,李小六,胡厚勇,胡薛英,王新华

（1.华中农业大学,湖北武汉430070；2.河南科技学院,河南新乡453003；3.河南黑马动物药业有限公司,河南郑州450003；4.济源市第一职业高中,河南济源454691；5.中国人民解放军71697部队,河南卫辉453100）

天一圆蓝瘟毒康对家兔细胞免疫功能的影响

逯艳云1,王芳2,李雪3,李小六4,胡厚勇5,胡薛英1,王新华2

（1.华中农业大学,湖北武汉430070；2.河南科技学院,河南新乡453003；3.河南黑马动物药业有限公司,河南郑州450003；4.济源市第一职业高中,河南济源454691；5.中国人民解放军71697部队,河南卫辉453100）

为研究天一圆蓝瘟毒康（复方黄芪多糖注射液）对家兔细胞免疫功能的影响,利用E玫瑰花环试验检测了家兔正常Et-花环形成率、Ea-花环形成率、药物体外作用后Ea-花环形成率以及体内用药后24 h Ea-花环形成率.结果表明：家兔Et-花环正常值为67.90%±2.45%,Ea-花环正常值为48.72%±4.37%；天一圆蓝瘟毒康体外试验Ea-花环形成率为61.66%±1.39%,体内试验Ea-花环形成率69.03%±0.99%,均有明显升高.天一圆蓝瘟毒康对动物细胞免疫功能的提高具有十分明显的作用,为该制剂的临床应用提供了理论依据.

圆蓝瘟毒康；细胞免疫；E-玫瑰花环；Et-花环；Ea-花环

淋巴细胞是动物机体重要的免疫细胞,它肩负着产生抗体和各种淋巴因子的作用,是动物机体抗御疾病的重要防线.淋巴细胞根据功能能和形态又分为B淋巴细胞和T淋巴细胞.其中T淋巴细胞（简称T细胞）掌管着细胞免疫和体液免疫的调控作用.T淋巴细胞是一个具有多功能的细胞群体.T细胞表面的CD2分子是绵羊红细胞（SRBC）的受体[1].此试验方法既可检测T细胞数量,又能反映T细胞的活性,从而可以判定机体的细胞免疫水平.在4℃条件下试验作用2 h形成的玫瑰花环,代表T细胞的总数,称为Et-花环.不经4℃反应立即形成的花环,称为活性花环（Ea-花环）,Ea-花环的数量变化可以反映人或动物机体的细胞免疫水平的变化.37℃30 min形成的花环称为稳定花环,代表未成熟的T淋巴细胞.

应用E玫瑰花环试验可以检测机体的免疫状态[2-3],从而可以帮助阐明发病机理,为临床诊断和治疗提供依据.活性T细胞更能反映出机体的的细胞免疫水平,Ea-花环增多,表明细胞免疫功能增强,也就是抗病能力增强.因此,本试验可用于检测动物机体的免疫状态[4-5]、检测药物对机体细胞免疫功能影响[6-11]、评价药物的疗效、检测生物制品的活性等[9,11].本文旨在通过E-玫瑰花环试验检测考核中药针剂天一圆蓝瘟毒康对家兔细胞免疫功能的影响,为该药品的临床应用提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 试验材料

天一圆蓝瘟毒康（复方黄芪多糖注射液）,河南黑马动物药业有限公司生产,批号20101102,由河南黑马动物药业有限公司提供；试验家兔由河南科技学院动物科学学院动物室提供,体重2.5 kg左右；绵羊血采自当地农户羊群；Hanks液自配；红细胞裂解液根据资料进行改进自配；瑞氏染色液自配；药品试剂：戊二醛、柠檬酸钠、柠檬酸、葡萄糖、氯化钠、氯化钾、碳酸氢钠、十二水磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化铵、碳酸氢钾、Na2EDTA等,所有药品、试剂均为分析纯.

1.2 试验方法

1.2.1 试剂配制

阿氏红细胞保存液配制：柠檬酸钠0.8 g、柠檬酸0.55 g、葡萄糖2 g、氯化钠0.42 g、蒸馏水加至100 mL.115℃,10 min灭菌,4℃保存.可用7～10 d.血液：阿氏液的比例1∶1～1∶2.用阿氏红细胞保存液保存的血液可用一周左右.

pH7.2～7.4无钙镁Hanks液配制：氯化钠9 g、氯化钾0.4 g、碳酸氢钠0.35 g、磷酸氢二钠（12结晶水）0.152 g、磷酸二氢钾0.06 g、葡萄糖1 g、蒸馏水1 000 mL,调pH至7.2～7.4,115℃,10 min高压灭菌, 4℃保存备用.

pH7.2～7.4红细胞裂解液配制：10%氯化铵4 mL、25%碳酸氢钾0.2 mL、20%Na2EDTA 0.1 mL、蒸馏水20.7 mL,共计25 mL.以上成分分别配制,临用前按比例混合即成,配置的混合液可用一周.

0.8 %戊二醛配制：25%戊二醛0.46 mL、Hanks液19.36 mL,共计20 mL.现用现配.

1.2.2 1%绵羊红细胞的制备新鲜3.8%柠檬酸钠抗凝绵羊全血经pH7.2Hanks液4次洗涤,每次3000 r/min 5min.最后用pH7.2Hanks液配制成1%红细胞悬液备用.用前混匀,4℃保存可用一周.阿氏红细胞保存液保存的绵羊全血处理方法相同.

1.2.3 家兔淋巴细胞的制备家兔耳静脉采血,3.8%柠檬酸钠抗凝.取0.1 mL置1.5 mL离心管中,加1 mL红细胞裂解液,室温作用2～3 min,待完全透明后,立即3 000 r/min离心5 min,倾倒出上清液,尽量吸出液体,仅留残液,加入Hanks液1 mL,3 000 r/min离心5 min,倾倒出上清液,再重复1次,一般洗涤2次即可,洗涤次数多可导致淋巴细胞变性失活.尽量吸出上清液,残液即为淋巴细胞液.家兔淋巴细胞现用现制备.

1.2.4 玫瑰花环（Et-花环、Ea-花环）正常值测定

Et-玫瑰花环形成试验：在制备好的家兔淋巴细胞悬液中加入50 μL 1%绵羊红细胞悬液充分混匀, 4℃作用2 h,500 r/min离心5 min,尽量吸去上清液,残液加0.8%戊二醛50 μL,4℃固定15～20 min,轻轻叩击离心管或反复用滴管吹吸将其混匀,涂片,自然干燥,甲醇固定1 min,瑞氏染液染色1 min,滴加等量常水再染1～2 min,镜检.凡结合3个以上红细胞的淋巴细胞算1个花环,每张片子计数200个淋巴细胞,应观察两张片子,按下式计算Et-花环形成率：

Et-花环形成率＝花环形成细胞数÷200×100%

Ea-花环形成试验：方法基本同上,只是在淋巴细胞悬液中加入绵羊红细胞后立即500r/min离心5 min,吸去上清液,加0.8%戊二醛50 μL,4℃固定15～20 min,轻轻将其混匀,涂片,自然干燥,甲醇固定1 min,瑞氏染液染色1 min,滴加常水再染1～2 min,镜检.凡结合3个以上红细胞的淋巴细胞算1个花环,每张片子计数200个淋巴细胞,按下式计算Ea-花环形成率：

1.2.5 天一圆蓝瘟毒康对Ea-花环形成率影响的体外试验

淋巴细胞激活：在淋巴细胞悬液中加入用生理盐水10倍稀释的天一圆蓝瘟毒康100 μL,37℃孵育15 min,加入50 μL绵羊红细胞悬液,立即500 r/min离心5 min,吸去上清液,加0.8%戊二醛50 μL,4℃固定15～20 min,轻轻将其混匀,涂片,自然干燥,甲醇固定1 min,瑞氏染液染色1 min,滴加常水再染1～2 min,镜检.凡结合3个以上红细胞的淋巴细胞算1个花环,每张片子计数200淋巴细胞,按下式计算Ea-花环形成率：

体外Ea-花环增长率＝（体外处理后Ea-花环形成率-处理前Ea-花环形成率）÷处理前Ea-花环形成率×100%

1.2.6 天一圆蓝瘟毒康对Ea-花环形成率影响的体内试验按0.2 mL/kg体重,给试验家兔皮下注射天一圆蓝瘟毒康原液,注射后24 h耳静脉采血,按2.2.2所述方法进行试验.

2 结果与分析

本次试验共用10只家兔,分别按2.2.1和2.2.2检测Et-花环和Ea-花环.并用同一份血样按2.3作体外试验.以检测试验家兔正常T淋巴细胞数值、活性T淋巴细胞数值和药物作用15 min后活性T淋巴细胞数值.然后按2.4作体内试验.每项试验每只家兔均作两张涂片,每张片子计数200个淋巴细胞,最后进行统计处理.结果如表1所示.

表1 试验前后E花环的数据

由表1可见,家兔正常Et-花环和Ea-花环的形成率分别为67.90%±2.45%和48.72%±4.37%.经天一圆蓝瘟毒康处理后,家兔体外试验Ea-花环形成率为61.66%±1.39%,Ea-花环的增长率为26.55%；给试验家兔皮下注射天一圆蓝瘟毒康原液24 h后,Ea-花环形成率为69.03%±0.99%,Ea-花环的增长率为41.68%.

3 结论与讨论

有关家兔的Et-玫瑰花环和Ea-玫瑰花环数据的报道极少,本试验检测了家兔Et-玫瑰花环形成率为67.90%±2.45%,即家兔的正常T淋巴细胞数占淋巴细胞总数的67.90%,这个数据与人的T淋巴细胞总数（60%左右[12]）相近,与王娅所报道的数据13.5%±2.55%[3]存在很大差异.活性淋巴细胞数占淋巴细胞的48.72%±4.37%.T细胞总数和活性T细胞数可以反映机体的细胞免疫状态.

本次体外和体内试验结果表明天一圆蓝瘟毒康与兔淋巴细胞作用后,活性T淋巴细胞明显增多.体外试验用药后活性花环为61.66%±1.39%,明显高于用药前的48.72%±4.37%,提高率为26.55%,差异极显著（P＜0.01）.体内试验用药后24 h其活性花环数高达69.03%±0.99%,较用药前的48.72%±4.37%提高41.68%,差异极显著（P＜0.01）.且比试验前T淋巴细胞总数67.90%±2.45%也略有升高.提示圆蓝瘟毒康不仅可以激活T淋巴细胞,还可能诱导淋巴细胞增殖.

本试验表明中草药制剂在提高动物机体免疫功能方面具有积极的意义,特别是在防治病毒性疾病上具有重要作用,而且无副作用,无残留.

应用E-玫瑰花环试验可以筛选具有免疫调节作用的中草药,也可对中草药制剂的作用进行科学的检验和考核.多数学者在做E-玫瑰花环试验时,采用淋巴细胞分离层液分离淋巴细胞,费工、费时、成本高.本文采用红细胞裂解液分离淋巴细胞,省工、省时、成本低廉,值得推广.

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（责任编辑：邓天福）

Influence of Yuanlanwendukang on cellular immunity function of rabbit

Lu Yanyun1,Wang Fang2,Li Xue3,Li Xiaoliu4,Hu Houyong5,Hu Xueying1,Wang Xinhua2
（1.HuazhongAgricultural University,Wuhan 430070,China；2.Henan Institute ofScience and Technology,Xinxiang453003,China；3.Henan Heima Pharmaceutical Group Co.Ltd.,Zhengzhou 453003,China；4.The First Occupation High Sschool ofJiyuan City,Jiyuan 454691,China；5.The Chinese Peoples Liberation ArmyUnit 71697,Weihui 453100,China）

To study the effects of Yuanlanwendukang on cellular immunity function of rabbit,erythrocyte-rosette formation test was used in this experiment to test the normal rate of rabbit erythrocyte-rosette formation,erythrocyterosette formation rate,erythrocyte-rosette formationrate rate after drug effection in vitro and administrationin in vivo after 24 h.The result shows that the normal value of Et-rosette and Ea-rosette are 67.90%±2.45%and 48.725± 4.37%respectively,Ea-rosette formation rate of Yuanlanwendukang in vitro or vivo are 61.66%±1.395 and 69.035± 0.99%respectively.Its rise is obvious.The results showed that Yuanlanwendukang improves cellular immune function of animals significantly,providing theory basis for the drug’s clinical application.

Yuanlanwendukang,cellular immunity,E-rosette,Et-rosette,Ea-rosette

S829.1

A

1008-7516（2011）06-0049-04

10.3969/j.issn.1008-7516.2011.06.013

2011-06-25

逯艳云（1985-）,女,河南夏邑人,华中农业大学硕士研究生.

王新华（1942-）,男,河南方城人,教授,主要从事家畜家禽的免疫研究.