第二信使环腺苷二磷酸核糖介导Ca2+释放的作用机制

李雪吟冯 琳，2，3刘 扬，2姜 俊，2周小秋，2，3*

(1.四川农业大学动物营养研究所，雅安 625014;2.四川农业大学鱼类营养与安全生产四川省高校重点实验室，雅安 625014;3.四川农业大学动物抗病营养教育部重点实验室，雅安 625014)

1989年，Lee等［1］在观察海胆受精过程中发现，精卵结合导致辅酶Ⅰ(NAD+)分解产生的环腺苷二磷酸核糖(cADPR)可激活相关钙库的离子通道。cADPR是多种细胞内调节Ca2+浓度的第二信使［2－3］。一系列的生理刺激都会引起胞内cADPR浓度的改变，cADPR通过激活内质网(肌浆网)上兰尼碱受体(RyR)通道，将内质网(肌浆网)内储存的 Ca2+释放到细胞质内［3－4］。cADPR可以在神经细胞、肌肉细胞和T淋巴细胞等多种细胞内调节Ca2+浓度，从而刺激神经细胞增殖分化［5］、介导肌细胞收缩［2，4］和激活 T 淋巴细胞［3］。本文主要对cADPR的合成方式及其在细胞内介导Ca2+释放的作用机制做一综述。

1 cADPR的化学结构

cADPR是由烟酰胺腺嘌呤二核苷酸分解产生，腺苷酸的N1位与核糖 C1″、腺苷酸N9位与核糖C1'分别以β构象相连，形成环化结构，同时腺苷酸上N6与C6位单键变为双键，从而增强了其活性。cADPR是由NAD+水解后的长链分子形成的头尾相连的环化结构，因此它在室温下比较稳定［6］。核糖的主要作用是通过其上的氧原子连接腺嘌呤与磷酸。研究表明，当用甲基取代C1″位氧原子后，cADPR失去活性，但即使用醚键取代核糖，cADPR 仍能引起 Ca2+的释放［7］。

2 cADPR的合成途径

在哺乳动物上，cADPR的合成是以β-NAD+为底物，由 CD38 酶催化产生［2，4］。CD38 是一种跨膜糖蛋白，活性中心位于胞外，6个不变氨基酸残基在活性中心形成口袋状结构，使NAD+和辅酶Ⅱ(NADP)能够和活性部位嵌合，使长链分子折叠，首尾相连形成环化结构，10个高度保守的半胱氨酸残基使二硫键位置固定，从而维持其高级结构［8］。CD38在脊椎动物造血组织、肌肉组织及内分泌组织中广泛的表达并具有多种酶的活性［9］。cADPR的生成需要NAD+与胞外的CD38活性中心反应，但NAD+主要存在于细胞内和血浆中，细胞外的浓度仅在 10 ～40 nmol/L［10］。NAD+可由连接蛋白43(Cx43)介导转运出胞。研究发现，当抑制小鼠3T3成纤维细胞膜上Cx43基因的表达后，细胞内外NAD+的双向转运被完全抑制［11］，同时胞内cADPR的含量也显著降低［12］。将纯化的Cx43基因构建于蛋白脂质体膜上，NAD+的转运活性得到了恢复［11］。Cx43是排列于各细胞间的六聚体通道蛋白，形成了细胞间的缝隙连接，可以通过它们进行细胞内和细胞间的物质交换［11］。NAD+的转运受到多种因素的调控。螯合NIH-3T3细胞内外Ca2+后，细胞内外NAD+的流量显著增高，而增加胞内Ca2+浓度后，NAD+的转运降至最低［11－12］。研究发现，Ca2+浓度的升高可激活蛋白激酶C引起Cx43磷酸化，磷酸化后的Cx43失去转运功能［12］。另外，小鼠成纤维细胞内NAD+的转运还与细胞膜上CD38的表达量呈反比关系［12］。cADPR作用的靶位点是细胞内Ca2+储存膜上的RyR［13］，因此细胞外合成的cADPR必须被运送至胞内才能发挥其生物学功能。cADPR的转运需要 CD38 的参与［11－12］，但 CD38 只能转运自身催化合成的cADPR，外源添加的cADPR不能被CD38转运至胞内［14］。CD38可能在催化过程中发生了构象改变，从而具有转运活性。CD38还可能在翻译后发生交联，从而形成多聚体，使其可能具有转运功能［15］。Franco 等［14］研究发现，蛋白脂质体膜上表达相对分子质量为46、86～112、197的3种类型的CD38，CD38可能以多聚体的形式形成了cADPR通道，使cADPR迅速内流。

生物体除了通过将底物转运出胞再将产物转运入胞这种相对复杂的方式合成cADPR外，它还可以通过配体介导CD38内化，使催化反应直接在胞内进行［9，16］。将人类 CD38基因转染到 Hela细胞，配体NAD+介导CD38以囊泡的形式逐渐内化［17］。白介素－8(IL-8)可诱导人类淋巴细胞因子激活的杀伤细胞表面的CD38内化［16］。CD38的内化与高度保守的半胱氨酸残基密切相关。研究发现，半胱氨酸－119和半胱氨酸－201位突变后的CD38分子不能内化，119位和201位半胱氨酸残基通过形成分子间二硫键，使CD38以二聚体形式内化［18］。内化的CD38仍具有酶的活性，能催化产生cADPR、调节Ca2+浓度［16］。在多种类型的细胞内，配体NAD+在引起细胞膜表面环化酶活性降低的同时，胞内Ca2+的浓度也升高，但如果CD38 缺失，这种作用则完全消失［9，16］。

3 cADPR介导胞内Ca2+释放途径

cADPR的主要功能是释放胞内储存的Ca2+。在海胆卵细胞［1］、小鼠成纤维细胞［12］、小鼠生精小管外周平滑肌细胞［2］及人 T 淋巴细胞［3］，cADPR都可引起胞内储存Ca2+的释放。cADPR释放Ca2+的途径是通过激活Ca2+储存膜上对兰尼碱敏感的 RyR［19－20］。但也有不一致的报道，cADPR 可以引起牛冠状动脉平滑肌细胞肌浆网膜RyR通道的开放，而抑制RyR通道活性后，cADPR不能引起Ca2+的释放［13］;在猪心肌RyR脂双分子层上，cADPR不能介导胞内Ca2+的释放［21］。RyR是由相对分子质量为560的多肽组成的同源四聚体对称型离子通道，它是一种跨膜蛋白，90%的氨基酸序列位于胞浆内，其上有多种调节蛋白的连接位点，他克莫司连接蛋白(FKBP)可与每个亚基上特异位点结合，并在一定程度上引起RyR的构象改变，从而调节其生物学功能［22］。FKBP在牛冠状动脉平滑肌细胞［19］、气管平滑肌细胞［20］、小鼠膀胱平滑肌细胞［23］内广泛地表达。特异表达的FKBP与肌浆网 RyR 结合［19－20］。FKBP 可以稳定RyR的关闭状态，从而抑制RyR的活性。将FKBP透析入气管平滑肌细胞，Ca2+通道的开放率显著降低，若使 FKBP与 RyR分离，Ca2+的释放增加［20］。FKBP还会减少由刺激引起的RyR通道的开放，由去极化诱导FKBP基因敲除的小鼠膀胱平滑肌细胞Ca2+的局部释放高于野生型小鼠［23］。cADPR激活RyR通道是通过与FKBP特异位点结合使FKBP与RyR分离。研究发现，cADPR可以引起牛冠状动脉平滑肌肌浆网膜Ca2+通道的开放，而 FKBP表达被抑制后，cADPR不能引起Ca2+的释放;将 cADPR透析入平滑肌细胞后，Ca2+的释放量显著增加，并且此时形成了cADPRFKBP复合物，使 FKBP与 RyR分离，Ca2+通道开放［19－20］。

cADPR激活RyR还需要钙调蛋白的参与。钙调蛋白相对分子质量为16.7，对Ca2+的亲和力很高，它能与RyR各亚基特异位点结合并调节其功能［22，24］。无钙调蛋白的海胆卵微粒体和鼠胰岛微粒体失去了对cADPR的敏感性，加入纯化的钙调蛋白后，其敏感性得以恢复，Ca2+释放增加［24］。钙调蛋白调节RyR通道活性的方式是通过与RyR复合物特异结合和分离这种循环过程来完成的［24］。影响钙调蛋白与RyR连接的主要因素是胞浆内游离Ca2+的浓度。当游离Ca2+的浓度改变时，兔心肌细胞内钙调蛋白与RyR的亲和力发生变化，引起RyR构象改变从而调节Ca2+通道的开放［25］。综上所述，cADPR激活RyR还需要钙调蛋白的参与，而胞浆内游离Ca2+的浓度又是影响钙调蛋白与RyR结合的主要因素，二者相互作用从而保证细胞内Ca2+浓度的平衡。

4 cADPR的生理功能

研究发现，cADPR是多种细胞内调节Ca2+浓度的第二信使。外源的刺激引起cADPR合成量增加，释放胞内储存的Ca2+，Ca2+浓度的升高引起信号转导，产生一系列生理反应［4］。在大鼠生精小管外周平滑肌细胞［2］、小鼠胰岛细胞［17］、人 T淋巴细胞［3］、PC12 细胞［5］，渗透化处理的 cADPR都可使胞内Ca2+浓度改变、引起肌细胞收缩、促进胰岛素分泌、活化T淋巴细胞和促进神经细胞增殖分化。外源的各种刺激主要是通过上调cADPR合成酶的分泌量，使cADPR合成增加。用内皮缩血管肽－1(ET-1)刺激大鼠生精小管外周平滑肌细胞，细胞膜上CD38酶的活性显著增强，平滑肌细胞收缩增强［2］。在不同组织中，cADPR的效应时间不同［5，17］，并且效应强度也有差别。在新西兰白鼠脉平滑肌细胞和PC12细胞内，cADPR拮抗剂只能部分抑制外援刺激引起的生理反应［4－5］。说明在不同细胞内由cADPR介导的Ca2+释放程度不同，可能还存在其它信号转导途径通过与cADPR途径协调作用，使生物体对外源刺激的调控机制更加精密。

表1 cADPR在不同组织内的第二信使功能Table 1 Roles of cADPR as a second messenger in various tissues

5 小结

cADPR是调节胞内Ca2+浓度的第二信使。通过传递细胞外的信号，释放胞内Ca2+储存，产生一系列相应的生理反应。cADPR的合成机制非常严密，不仅底物与酶由区室化的细胞器隔开，而且生成的产物也必须由催化激活的转运体转运入胞内发挥功能。生物体还可直接将CD38内化，从而使整个过程在胞内进行。生成的cADPR激活胞内Ca2+储存膜上的RyR，这个过程可能需要FKBP和钙调蛋白的参与，使胞内Ca2+调控机制更加精密。目前的研究主要集中于cADPR功能的研究，对外源刺激引起cADPR合成的分子机制还不清楚，有待进一步深入研究。目前对cADPR的靶位点RyR的分子结构研究较少，而认识RyR的分子结构也是我们深入了解cADPR在体内发挥作用的前提。

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