听力复筛未通过的新生儿常见聋病易感基因筛查结果分析△

周佳霖 历建强 罗仁忠 王大勇 温瑞金 纪育斌 王秋菊

听力复筛未通过的新生儿常见聋病易感基因筛查结果分析△

周佳霖1历建强2罗仁忠1王大勇2温瑞金1纪育斌2王秋菊2

目的 对听力复筛未通过的新生儿进行聋病易感基因筛查和听力学评估，探讨新生儿听力联合基因筛查的临床意义。方法 对2007年5月至2007年12月复筛未通过转诊至广州市儿童听力诊断中心的200例新生儿，运用筛查型OAE、AABR、声导抗、40 Hz－AERP等进行听力学评估和医学诊断。对所有新生儿应用遗传疾病筛查采样卡采集足跟血，进行耳聋易感基因包括线粒体12Sr RNAm.A1555G、GJB2基因c.235delC、SLC26 A4基因c.919－2 A＞G聚合酶链扩增反应（PCR），Alw26I限制性内切酶筛查线粒体12Sr RNAm.A1555G点突变，对酶切阳性病例进行PCR产物测序验证；对GJB2基因编码区和SLC26A4基因c.919－2A＞G突变位点所在区域进行PCR产物的直接测序。DNAStar软件对测序结果进行比对分析。结果 200例未通过听力复筛的新生儿中，190例听力正常，最终确诊10例听力损失，其中，6例单耳听力损失，4例双耳听力损失。基因检测结果显示：6例为GJB2基因c.235delC突变，占3%（6／200），其中，2例为GJB2基因c.235delC纯合突变，占1%，4例为GJB2基因c.235delC杂合携带，占2%；1例为SLC26 A4基因c.919－2A＞G杂合携带，占0.5%（1／200）；未发现线粒体12Sr RNAm.A1555G点突变。这7例基因筛查结果异常者中，2例为双耳重度听力损失，5例双耳听力正常。结论

新生儿； 听力筛查； 基因； 耳声发射； 自动判别听性脑干反应

随着分子生物学和遗传学的不断发展，耳聋的遗传相关性逐渐被确立。目前，已有100多个耳聋相关基因被确立，其中30多个耳聋相关基因已经被克隆。经流行病学统计，线粒体12Sr RNAm.A1555G、GJB2基因c.235delC和SLC26A4基因c.919－2 A＞G被确定为中国人群中最常见耳聋基因突变位点［1］。因此，2007年我国开始试点实施新生儿听力和耳聋易感基因联合筛查［2］。本研究对广州市200例听力复筛未通过的新生儿进行听力和基因联合筛查，探讨新生儿听力和聋病易感基因联合筛查的意义及可行性。

1 对象与方法

1.1 对象 选取2007年5月至2007年12月在广州市出生且未通过听力复筛而转诊至广州市儿童医院听力诊断中心的200例新生儿为研究对象，其中男150例，女50例，男女比例为3：1。

1.2 方法

1.2.1 听力筛查方法 新生儿在当地保健院出生后，3天内采用筛查型耳声发射（OAE）进行初筛，42天采用筛查型OAE或／和自动判别听性脑干反应（AABR）进行复筛。初筛和复筛均未通过的婴幼儿在3个月内转诊到广州市儿童医院听力诊断中心做听力学评估。

1.2.2 听力学评估方法 对所有转诊新生儿均行行为测听、ABR、DPOAE、声导抗、40 Hz－AERP等测试检查，综合评价和分析听力情况。

1.2.3 耳聋易感基因的检测 所有新生儿采用中国人民解放军总医院耳鼻喉科研究所自行设计的含有听力筛查信息和血样信息的新生儿遗传疾病筛查采样卡（实用型发明专利－200720103139.4）采集新生儿足跟血。自然晾干后密封保存，邮寄往国家人类基因组北方中心分子遗传实验室，直接用于线粒体12Sr RNA、GJB2基因、SLC26A4基因的聚合酶链扩增反应（polymerasechain reaction，PCR）。线粒体12Sr RNA扩增的PCR产物，应用Alw26I限制性内切酶筛查线粒体12Sr RNAm.A1555G点突变，对酶切阳性病例进行PCR产物测序验证；GJB2基因编码区和SLC26A4基因c.919－2 A＞G突变位点所在区域的扩增的PCR产物，进行PCR产物的直接测序［2］。使用DNAStar软件对测序结果进行比对分析。

1.2.4 随访 对所有转诊的婴幼儿随访至少两年，动态观察小儿的听力和语言发育情况。

2 结果

2.1 新生儿听力学评估和医学诊断结果 200例新生儿听力评估结果见表1，190例双耳听力正常，最终确诊10例听力损失新生儿，其中，6例单耳听力损失，4例双耳听力损失（其中2例为GJB基因c.235delC纯合突变）。听力损失分级按WHO－1997年听力障碍分级标准［3］，单耳轻度听力损失1例，重度听力损失5例；双耳轻度听力损失2例，重度听力损失2例。

2.2 新生儿基因筛查结果 200例新生儿中，mt12Sr RNAm.A1555G基因筛查均为阴性，未见致病突变；SLC26A4基因c.919－2A＞G突变筛查发现1例为杂合携带，占0.5%（1／200）；GJB2基因筛查发现6例新生儿的基因型为GJB2基因c.235delC，占3%（6／200），其中4例为GJB2基因c.235delC杂合突变，占2%，2例为GJB2基因c.235delC纯合突变，占1%（表2）。这7例基因筛查结果异常者中，2例为双耳重度听力损失，其中病例6在随访中听力结果好转为中度。5例双耳听力正常。

表1 未通过听力筛查新生儿听力学评估结果（例）

表2 7例基因检测结果阳性的听力损失程度、出生及家族史情况

3 讨论

目前，OAE与AABR的联合听力学检测已被认为是最经济、有效、方便的筛查方式［4］。有资料显示，OAE的灵敏性为99.51%，特异性约为68.65%［5］；ABR的敏感性多数报道为100%，特异性为94.0%～99.1%［6］，所以，在筛查过程中，假阴性和假阳性很难避免。2000年的形势报告［7］中也指出ABR和OAE两种技术都可以显示假阴性结果，部分新生儿因为中耳腔内羊水和胎脂的暂时性存留影响中耳功能而使听力筛查不能通过，随着羊水逐渐被排出和吸收后复筛时将通过听力筛查。部分新生儿还会因为神经系统发育不成熟导致AABR筛查不能通过，随着新生儿月份的增长，神经系统逐步发育成熟后对刺激更加敏感，复筛时听力筛查将通过。本研究结果可见，随着新生儿出生月份的增长，部分新生儿尤其第一次评估为轻度听力下降的新生儿听力逐渐恢复正常。

2007年我国开始试点实施新生儿听力和聋病易感基因联合筛查后，已取得重大成效，部分听力筛查不能早期发现的迟发性耳聋患者被确立并做到目标性随访。本研究确诊的10例听力损失的新生儿中，2例为GJB2基因c.235delC纯合突变，分别为中、重度耳聋。由GJB2基因突变引起的耳聋的发生率约为20%［8］，且GJB2基因c.235delC纯合突变在新生儿出生时即可表现出听力损失，所以对GJB2基因c.235delC纯合突变新生儿可以早期给予相应的干预，也可以对家长给予充分明确的解释。这2例GJB2c.235delC纯合突变新生儿，均于出生后6个月内选配了合适的助听器，经语训后取得了理想的效果。另外，本研究发现的4例GJB2基因c.235delC杂合突变患儿，随访至今没有出现听力损失，但很多研究报道，GJB2基因杂合突变会出现迟发性的高频听力下降，因此必须坚持长期随访，一旦出现听力损失，及时给予相关的干预，将听力损失控制在最低限度，防止聋哑的发生。另外，此4例杂合携带者若日后与相同基因型携带者婚配将有25%的概率产生耳聋后代，对他们进行婚育指导可防止耳聋后代的发生。可见，对这类人群进行相关基因筛查具有长远的现实意义，这是单纯听力筛查无法做到的。

线粒体12Sr RNAm.A1555G阳性新生儿出生时可表现为听力正常，日后若使用氨基糖苷类抗生素会出现“一针致聋”的情况，所以只有通过基因筛查才能做到早期发现和早期预防。据报道，线粒体12Sr RNAm.A1555G突变在新生儿中的发生率约为5%～12%［9～11］，本研究由于研究对象较少，未发现该基因突变者，所以，扩大筛查范围非常必要。本研究发现1例SLC26A4 c.919－2A＞G杂合携带者，由于SLC26 A4基因片段较大，极具异质性，21个外显子都有可能发生突变，而本研究目前仅针对最易发生突变的P8外显子进行筛查，很有可能同时存在其他外显子的突变，也就是说该例c.919－2A＞G杂合携带者不能排除复合杂合的可能。复合杂合携带者对听力的影响与纯合突变一样，出生时可表现为听力正常，或者轻～重度听力损失，感冒、颅脑震荡等因素可诱发听力损失或进一步的听力下降，所以，对该例SLC26A4基因c.919－2A＞G杂合携带者必须长期随访，避免上述诱因，预防耳聋的发生，一旦出现耳聋，及时干预。国人大前庭水管患者SLC26A4基因研究表明，92.1%的中国患者存在该基因的突变［12］。所以，扩大和推广新生儿聋病易感基因筛查是非常必要的。

综上所述，新生儿听力联合聋病易感基因筛查，能发现部分单纯听力筛查不能发现的迟发性耳聋高危患儿，扩大重点随访－干预对象，若干年后将大大降低聋哑的发生率，有长远的现实意义，具有可行性。但目前仍有大量耳聋基因未被定位和克隆，并不是所有的新生儿听力损失都能通过基因筛查被发现，故基因筛查并不能代替新生儿听力筛查。

1 郭玉芬，关静，徐百成，等.甘肃省盲聋哑学校283名聋哑学生的病因分析［J］.中华耳科学杂志，2006，4：30.

2 王秋菊，赵亚丽，兰兰，等.新生儿聋病基因筛查实施方案与策略研究［J］.中华耳鼻咽喉头颈外科杂志，2007，42：809.

3 孙喜斌，李兴启，张华.中国第二次残疾人抽样调查听力残疾标准介绍［J］.听力学及言语疾病杂志，2006，14：447.

4 Lin HC，Shu MT，Lee KS.comparison of hearing screening programs between one step with transient otoacoustic emission（TEOAE）and two step with TEOAE and auto－auditory brainstem response［J］.Laryngoscope，2005，115：1 957.

5 贺鹭，曲成毅，孙喜斌.应用耳声发射技术对48041名新生儿进行听力筛查的汇总分析［J］.中国听力语言康复科学杂志，2005（1）：21.

6 Stewart DL，Mehl A，Hall JW，et al.Universal newborn hearing screening with automated auditory brainstem response：A multisite investigation［J］.J Perinatol，2000，20：S128.

7 Joint Commitee on infant hearing.Year 2000 position statement：principles and guidelines for early hearing detection and intervention programs［J］.Pediatrics，2000，106：798.

8 王秋菊.新生儿聋病易感基因筛查的意义与策略［J］.中国医学文摘耳鼻咽喉科学，2007，22：21.

9 王秋菊，韩东一，郭玉芬，等.遗传性耳聋资源收集保存及基因定位克隆［J］.中国耳鼻咽喉头颈外科，2006，13：661.

10 管敏鑫，赵立东.与氨基糖甙类抗生素耳毒性相关的线粒体12S rRNA突变的流行病学特征［J］.中华耳科学杂志，2006，4：98.

11 郭玉芬，徐百成，韩东一，等.中国西北地区线粒体DNA 12Sr RNAA1555G和GJB2基因突变［J］.中国耳鼻咽喉头颈外科，2006，13：666.

12 赵亚丽，李庆忠，翟所强，等.国人前庭水管扩大患者SLC26A4基因的特异性突变［J］.听力学及言语疾病杂志，2006，14：93.

（2010－04－26收稿）

（本文编辑 雷培香）

The SusceptibiIity Genes in FaiIed Newborns in Hearing Screening Programs

Zhou JiaIin*，Li Jianqiang，Luo Renzhong，Wang Dayong，Wen Reijin，Ji Yubing，Wang Qiuju
（*Department of OtoIaryngoIogy，Guangzhou ChiIdren＇s HospitaI，Guangzhou，510120，China）

Objective To discuss and analyze the clinical significance of combined genetic and hearing screenings administered to newborns failed hearing re－screening in the identification of newborn hearing impairment.Methods 200 newborn babies in Guangzhou from December 2006 to May 2007，after failure of the hearing rescreening，received the audiological assessment and medical diagnosis.Otoacoustic emission（OAE），auto－auditory brainstem response（AABR），and 40 Hz－AERP were employed as part of the audiological protocol.Newborn genetic disease screening cards were used to collect the blood samples from the umbilical cords within three months.The cards could directly perform the polymerase chain reaction（PCR）for screening the mitochondrial 12Sr RNAm.A1555G and GJB gene as well as SLC26A4c.919－2A＞G genes mutation.The restriction enzyme Alw26I was used to recognize the point mutation of 12Sr RNAm.A1555G.The samples with the possible 12Sr RNAm.A1555G mutation were then sequenced for verification.The PCR products from the GJB2 coding region and SLC26 A4 c.919－2A＞G mutations hot spot region were sequenced directly.The software of DNAStar was used to analysis the sequence.ResuIts For 200 failed babies，190 babies passed re－screening but 10 were confirmed with hearing loss.In these，4 babies were confirmed with bilateral hearing loss，including 2 babies showing GJB2c.235delC genotype in the gene screening，and 6 babies were confirmed with unilateral hearing loss.The newborn gene screening results indicate that GJB2 genetic screening identified 6 cases for 235delC genotype，3%，including 4 cases for 235delC heterozygous，2%，2 cases for 235delC homozygous，1%.SLC26A4 gene screening，and 1 case for SLC26A4 c.919－2 A＞G heterozygous.No case for 12Sr RNAm.A1555G mutation was found.ConcIusion The newborn gene screening may approve to be a valuable addition into the hearing screening protocol in order to identify early hearing loss for effective management.

Newborns； Hearing screening； Genes； OAE； AABR

10.3969／j.issn.1006－7299.2011.01.005

R764.44

A

1006－7299（2011）01－0014－04

△ 国家863项目（2006AA02Z181）、国家自然基金重点项目（30830104）、国家自然基金面上项目（30672310＆30771203）、北京市重大专项课题项目（7070002）、国家“十一五”科技支撑计划（2006BAI02B06＆2007BAI18B12）、广州市科技攻关计划重大项目（2005Z1－E0105）、广东省科技厅社会发展计划项目（2008－108－83088）联合资助

1 广州市儿童医院耳鼻咽喉科（广州 510120）； 2 解放军总医院耳鼻咽喉－头颈外科，解放军耳鼻咽喉研究所（北京 100853）

周佳霖，女，浙江人，医师，主要从事临床听力学及分子遗传学的研究。周佳霖，历建强为并列第一作者。

王秋菊（Email：wqcr＠263.net）； 罗仁忠（Email：luorenzhong＠21cn.com）

新生儿听力联合聋病易感基因筛查，能发现部分单纯听力筛查不能发现的迟发性听力损失高危患儿，扩大重点随访对象。