Caspase－9和Livin在中耳胆脂瘤中的表达及意义

陈秀兰 秦兆冰 陈晓华

Caspase－9和Livin在中耳胆脂瘤中的表达及意义

陈秀兰1秦兆冰1陈晓华1

目的 研究凋亡相关蛋白Caspase－9和Livin在中耳胆脂瘤上皮组织中的表达，揭示二者在中耳胆脂瘤发生发展中的作用。方法 采用免疫组化法检测凋亡促进蛋白Caspase－9和凋亡抵制蛋白Livin在23例中耳胆脂瘤及10例正常外耳道皮肤组织中的表达，对染色结果进行量化处理和统计学分析。结果 Caspase－9和Livin蛋白在中耳胆脂瘤上皮的表达均高于在正常外耳道皮肤中的表达（P＜0.01）；二者在胆脂瘤中的表达呈正相关，相关系数r＝0.848（P＜0.05）。结论 凋亡促进蛋白Caspase－9和凋亡抑制蛋白Livin在中耳胆脂瘤中的表达同步升高，提示就凋亡过程而言，二者达到了新的平衡。

Caspase－9蛋白； Livin蛋白； 胆脂瘤； 细胞凋亡

中耳胆脂瘤是一种常见病，其主要表现为中耳腔存在大量的增殖角化鳞状上皮和邻近骨质的破坏、吸收及角化细胞凋亡，导致腔内角化碎屑的堆积。胆脂瘤的发生、发展有很多复杂的因素，但其发病的确切机制目前仍不完全清楚。细胞凋亡在肿瘤的发生发展中主要起负调控作用［1］，近年来国内外学者就细胞凋亡调控因子与胆脂瘤发生发展的关系进行了研究，如Albino等［2］用特异性的单克隆抗体检测P53和Ki67在胆脂瘤上皮细胞中的表达，结果表明P53的表达比正常皮肤中的表达高9～20倍，说明P53参与了胆脂瘤上皮细胞的凋亡机制；Olszewska等［3］发现Apo2.7在胆脂瘤上皮细胞凋亡中起着重要的作用，Kojima等［4］在胆脂瘤中检测出Bcl－xl能诱导细胞凋亡，说明胆脂瘤细胞凋亡是多因素参与的过程。与正常外耳道皮肤相比，促凋亡蛋白在中耳胆脂瘤中的表达明显增高，提示胆脂瘤上皮细胞凋亡能力增强，但对凋亡抑制蛋白在中耳胆脂瘤中的表达报道不一致，如关芳灵等［5］报道凋亡抑制蛋白XIAP在中耳胆脂瘤中是低表达或不表达；而李冬等［6］研究示凋亡抑制蛋白Bcl－2在胆脂瘤中的表达水平显著增高。Caspases蛋白酶解级联反应是细胞凋亡的核心机制，是细胞凋亡的中心环节和执行者［7，8］，Caspase－9是Caspases家族中位于最上游的重要成员，是Caspase系统引起细胞凋亡的最重要的起始因子。凋亡抑制蛋白家族的新成员Livin参与细胞凋亡的调控，促凋亡蛋白Caspase－9和凋亡抑制蛋白Livin在中耳胆脂瘤中的表达情况尚不清楚。为了探讨Livin和Caspase－9蛋白在中耳胆脂瘤组织中的作用，本研究对23例中耳胆脂瘤和10例正常外耳道皮肤进行了研究，以进一步探讨中耳胆脂瘤的发病机制。

1 材料与方法

1.1 一般资料 2006年7月～2008年7月郑州大学第一附属医院耳鼻咽喉头颈外科中耳胆脂瘤患者手术标本23例，男9例，女14例；年龄10～76岁，平均42±12.01岁，病程6个月～55年，平均5.5± 11.13年。全部患者术前经颞骨高分辨CT检查及术后病理检查证实为中耳胆脂瘤。取开放式乳突根治手术的中耳胆脂瘤组织和外耳道后壁正常皮肤标本，迅速固定。所有患者均签署知情同意书。

1.2 免疫组织化学SP法 兔抗人Caspase－9和Livin多克隆抗体均购自美国SANTACRUZ公司，免疫组化SP试剂盒购自北京中杉生物技术有限公司，DAB显色试剂盒购自北京中杉生物技术有限公司。所有新鲜标本取出后迅速放入10%中性甲醛溶液充分固定，常规石蜡包埋，4μm厚连续切片，染色程序按说明书进行［9，10］。用已知的Caspase－9和Livin阳性切片作阳性对照，以PBS代替一抗，作阴性对照。

结果判定：免疫组化阳性表达均为黄棕色颗粒，Caspase－9阳性表达主要定位于细胞浆和核膜，Livin阳性表达主要定位于细胞浆。每张切片于400倍光镜下选取不相叠的5个视野，测量阳性细胞的平均灰度值，取其均值为该标本测量结果。

1.3 统计学方法 采用SPSS10.0统计软件包分析数据，Livin和Caspase－9蛋白表达量的差异用t检验；用回归分析法分析两者的相关性，P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 23份胆脂瘤标本HE染色中均含有角化碎屑或者胆固醇结晶，并都含有胆脂瘤上皮，为复层鳞状上皮，不同部位鳞状上皮分层不同；鳞状上皮可见明显的局部乳头状生长，在乳头状生长的部位，鳞状上皮分层尤其不规则。

2.2 Caspase－9和Livin蛋白在胆脂瘤和正常皮肤中的表达 Caspase－9蛋白在中耳胆脂瘤上皮细胞由基底层向外至角质层细胞中均有不同程度染色，但主要分布在颗粒层和棘层，表达密集（图1）；在外耳道正常皮肤中的表达虽然也分布在颗粒层和棘层，但表达稀疏（图2）；Livin蛋白在中耳胆脂瘤上皮细胞由基底层向外至角质层细胞中均有不同程度染色（图3）；在外耳道正常皮肤中的表达主要分布在基底层和基底上层，表达稀疏（图4）；Caspase－9和Livin蛋白在中耳胆脂瘤上皮的表达比在正常外耳道皮肤中的表达范围广，且表达水平也明显增强，阳性平均灰度值比较见表1。

图1 Caspase－9蛋白在胆脂瘤中的表达（SP×400）图3 Livin蛋白在胆脂瘤中的表达（SP×400）

表1 胆脂瘤和外耳道正常皮肤中Caspase－9蛋白和Livin蛋白表达灰度值（¯x±s）

2.3 Caspase－9和Livin蛋白表达相关性研究Caspase－9和Livin蛋白在胆脂瘤中的表达呈正相关，r＝0.848（P＜0.05）。

3 讨论

图2 Caspase－9蛋白在正常皮肤中的表达（SP×400）图4 Livin蛋白在正常皮肤中的表达（SP×400）

Livin是新发现的凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）家族成员之一，与Survivin具有同源性。它含有一个IAP家族特征性的杆状病毒IAP重复序列（baculoviral IAP repeat，BIR）结构域和羧基端的环状指样结构区域（RIAG Zinc－finger domain）。Livin在正常成人的大多数组织中不表达［11］，在表皮、淋巴结、脾脏和黑色素细胞中弱表达，在胎儿的脑、胸腺、肾脏和肝等组织中高表达［12］。Livin主要通过和Caspase蛋白结合抑制其级联激活反应而发挥抗凋亡作用。Nachmias等［13］的研究发现，Livin可以和Caspase－9结合，在凋亡的起始阶段起抗凋亡作用。

本研究显示，Caspase－9蛋白在中耳胆脂瘤上皮的表达主要在颗粒层和棘层，表达密集，在正常外耳道皮肤中的表达主要位于颗粒层，表达稀疏，二者之间的差异有统计学意义（P＜0.05），与Miyao等［14］研究结果Caspase－3和Caspase－8在中耳胆脂瘤中高表达相符。说明胆脂瘤上皮细胞有很强的凋亡能力，这与肿瘤细胞的无限制的增殖并且能抵御凋亡的能力完全不同［15］。促凋亡蛋白Caspase－9在中耳胆脂瘤中的高表达，说明Caspase－9在胆脂瘤上皮的细胞凋亡中起着很重要的作用，使其凋亡能力增强，造成大量的胆脂瘤角质细胞堆积，并使快速增殖的胆脂瘤细胞受到抑制，说明Caspase－9在中耳胆脂瘤的凋亡机制中发挥重要的作用。。Livin蛋白在中耳胆脂瘤上皮的表达比正常外耳道皮肤中的表达范围广，且表达水平也明显增强，二者之间的差异有统计学意义（P＜0.05），与Park等［16］研究结果Survivin在中耳胆脂瘤中高表达相符。凋亡抑制蛋白Livin在胆脂瘤组织中异常表达，说明Livin参与了胆脂瘤上皮的凋亡调控过程，在胆脂瘤的发生、发展过程中起重要作用。

本研究显示，促凋亡蛋白Caspase－9和抑制凋亡蛋白Livin在胆脂瘤中的表达呈正相关，因此可以认为，由于Caspase－9和Livin蛋白的相互作用，使胆脂瘤上皮细胞凋亡保持相对平衡状态。而Caspase－9蛋白低表达，细胞凋亡受抑制，二者呈负相关。减少Livin的产生可能会有效减少中耳胆脂瘤细胞凋亡的抑制，这样，也许就为我们提供了另一种治疗胆脂瘤型中耳炎的新途径和新思路，但Livin参与中耳胆脂瘤细胞凋亡具体机制还有待研究。

1 Mitza A，McGuirk M，Hockenberry TN，et al.Human survivin is negatively regulated by wild－type P53 and participates in P53－depend apoptotic pathway［J］.Oncogene，2002，21：2 613.

2 Albino AP，Reed JA，Bogdany JK，et al.expression of P53 protein in human middle ear cholesteatomas：pathogenetic impications［J］.Am J Otol，1998，19：30.

3 Olszewska E，Chodynicki S，Chyczewsk L.Apoptosis in the pathogenesis of cholesteatoma in adults［J］.Eur Arch Otorhinolaryngol，2006，263：409.

4 Kojima H，Miyazaki H，Tanaka Y，et al.Role of Bcl－xl protein in differentiation and apoptosis of human middle ear cholesteatoma epithelium［J］.Arch Otolaryngol Head Neck Surg，1999，125：738.

5 关芳灵，马敏，尚丽芳，等.X连锁凋亡抑制蛋白在胆脂瘤中的表达及其与细胞凋亡的关系［J］.山西医药杂志，2008，37：492.

6 李冬，黄芳，龚树生，等.凋亡抑制蛋白survivin及Bcl－2在中耳胆脂瘤上皮中的表达及意义［J］.中国耳鼻咽喉颅底外科杂志，2006，12：334.

7 Ashe PC，Berry MD.Apoptotic signaling cascades［J］.Prog Neuro Psychopharmacol Biol Psychiatry，2003，27：199.

8 Boatright KM，Salvesen GS.Mechanisms of caspase activation［J］.Current Opinion in Cell Biology，2003，15：72.

9 Hamzei M，Ventriglia G，Hagnia M，et al.Osteoclast stimulating and differentiating factors in human cholesteatoma［J］.Laryngoscope，2003，113：436.

10 Jeong JH，Park CW，Tae K，et al.Expression of RANKL and OPG in middle ear cholesteatoma tissue［J］.Laryngoscope，2006，116：1 180.

11 Lin JH，Deng G，Huang Q，et al.KIAP，a novel member of the inhibitor of apoptosis protein family［J］.Biochem Biophys Res Commun，2000，279：820.

12 Vucic D，Stennicke HR，Pisabarrom T，et al.ML－IAP，a novel inhibitor of apoptosis that is preferentially expressed in human melanomas［J］.Curr Bio I，2000，10）：1 359.

13 Nachmias B，Ashhab Y，Bucholtz V，et al.Caspase－mediated cleavage converts livin from an antiapoptotic to a proapoptotic factor：implications for drug－resistant melanoma［J］.Cancer Res，2003，63：6 340.

14 Miyao M，Shinoda H，Takahashi S.Caspase－3，caspase－8 and nuclear factor－KappaB expression in human cholesteatoma［J］.Otol Neurotol，2006，27：8.

15 余其林，金康业.中耳胆脂瘤上皮细胞增生与凋亡状态的研究［J］.临床耳鼻咽喉科杂志，2001，15：450.

16 Park HR，Min SK，Min K，et al.Increased expression of P63 and survivin in cholesteatomas［J］.Acta Otolaryngol，2009，129：268.

（2010－05－10收稿）

（本文编辑 雷培香）

Expression and Significance of Caspase－9 and Livin in the MiddIe Ear ChoIesteatoma

Chen XiuIan，Qin ZhaoBin，Chen Xiaohua
（Department of OtorhinoIaryngoIogy，the First AffiIiated HospitaI of Zhengzhou University，Zhengzhou，450052，China）

Objective To investigate the effect of caspase－9 apoptosis protein and the inhibitor of apoptosis protein livin in the middle ear cholesteatoma.Methods The expressions of caspase－9 and livin in 23 cholesteatoma and 10 normal cases of exteral meatal skin were studied with immunohistochemistry.Semiquantitative analysis was used for comparision and statistical analysis.ResuIts ①The gray values of caspase－9 and livin in the cholesteatoma were signifincantly higher than in the exteral meatal skin（P＜0.05）.②Caspase－9 and livin had both positive staining in 14 cases，while caspase－9 and livin had both negative staining in 4 cases，and livin had positive staining but Caspase－9 staining was absent in 1 case.Caspase－9 had positive staining but livin staining was absent in 4 case of the corelation analysis（P＜0.05）.ConcIusion The expressions of caspase－9 and livin in the middle ear cholesteatoma made the apoptosis reach a new balance，which was different from those in maligant tumors.

Caspase－9； Livin； Cholesteatoma； Apoptosis

10.3969／j.issn.1006－7299.2011.01.014

R764.2

A

1006－7299（2011）01－0044－03

1 郑州大学第一附属医院耳鼻咽喉科（郑州 450052）

陈秀兰，女，河南人，主治医师，主要研究方向为听力学。

秦兆冰（Email：qzb＠zzu.edu.cn）