抗凝护心Ⅱ号对心肌缺血再灌注损伤后大鼠心肌组织基质金属蛋白酶－9的影响

陈波，张虹，曹纯洁

(1.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040;2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

近年来，随着冠心病介入治疗技术的快速发展，实现冠脉再通已经不是难题，但是心肌缺血再灌注后不可逆性损伤及心肌缺血、坏死，心肌超微结构的改变都严重影响急性冠脉综合征(ACS)的预后。研究发现，MMPS是细胞外基质(ECM)代谢过程中重要的蛋白酶，可以降解ECM，不仅削弱纤维帽的结构，增加粥样硬化斑块的不稳定性，加速斑块破裂和促进血栓形成，还可促进心肌梗死后胶原纤维沉积，参与心室重构，影响心功能，其中MMP－9作用明显。同时还发现在心肌缺血数分钟内MMP－9表达即上调。本实验通过观察各实验组动物心肌缺血再灌注损伤模型的心肌病理组织学改变及MMP－9表达的变化探讨以抗凝护心Ⅱ号对心肌缺血再灌注损伤心肌的保护作用及可能的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

清洁级Wistar大鼠50只(黑龙江中医药大学动物实验中心提供)，体质量(250±20)g，雌雄各半。

1.1.2 实验用药

抗凝护心Ⅱ号:由川芎、黄芪、桃仁、红花、当归、赤芍、党参、川牛膝、地龙、水蛭、枳壳等组成，药材均购自黑龙江省药材公司，由黑龙江中医药大学附属第一医院煎药室煎煮浓缩而成。

通心络胶囊:石家庄以岭药业股份有限公司提供。批号(080822)。

1.1.3 主要仪器及设备

心电机(6511型，上海KOHDEN电子有限公司);小动物呼吸机(DH－50型，浙江大学医疗仪器厂生产);电子分析天平(梅特勒－托利多仪器(上海)有限公司);低温冰箱(MDF－U50V日本三洋公司产品);AO轮转式电机(徕佧2135型，德国);恒温水浴箱(上海实验仪器厂);显微摄像显微镜(Olympus B×60，日本);图像分析系统(麦克奥迪公司 MED 6.5，中国厦门)。

1.1.4 主要试剂及溶液

anti－matrix metalloproteinase－9试剂(武汉博士得生物工程有限公司提供);PV－6001 Power Vision 9(2－step)(北京中杉生物技术有限公司);DAB显色试剂盒(北京中杉生物技术有限公司);EDTA二钠、抑肽酶药盒(武汉博士得生物工程有限公司提供);0.9%生理盐水(黑龙江哈尔滨三联药业有限公司提供，批号081001);麻醉剂(20%乌拉坦溶液5ml/kg);乙醇、蒸馏水、二甲苯溶液、苏木素液、3%H2O2溶液(黑龙江中医药大学附属第一医院病理科提供);PBS缓冲液 (自配，蒸馏水 200ml，Na2HPO4·12H2O 5.802g，NaH2PO4·2H2O 0.592 8g，溶于 2 000mL 水中成0.01 MPB液，加入NaCl 117mg，用NaOH滴定，pH=6.3);固定液T(10%甲醛溶液)

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组

50只清洁级Wistar大鼠，随机分为5组，假手术组、模型组、抗凝护心Ⅱ号高剂量组、抗凝护心Ⅱ号低剂量组、通心络组，每组各10只，相同条件下分笼饲养。

1.2.2 给药方法

5组实验动物分别按下列剂量给药14天。

假手术组:每天灌服生理盐水10mL/kg。模型组:每天灌服生理盐水10mL/kg。抗凝护心Ⅱ号高剂量组:每天灌服0.72g/mL抗凝护心Ⅱ号，10mL/kg。抗凝护心Ⅱ号低剂量组:每天灌服0.24g/mL抗凝护心Ⅱ号，10mL/kg。通心络组:每天灌服0.05g/mL通心络，10mL/kg。

1.2.3 模型建立［1－2］

按上述给药方法灌胃14天后，于末次灌胃30min后手术造模。

1.2.4 组织学切片标本及MMP－9免疫组化染色

造模结束后，处死大鼠，在心底部将心脏与大血管及组织分离，切取坏死心肌组织分成两部分，用中性福尔马林固定24h，逐级梯度乙醇脱水(50%乙醇12h，70%乙醇12h，80%乙醇2h，90%乙醇1.5h，95%乙醇1.5h，100%乙醇2次，分别为 1h，1.5h)，然后石蜡包埋，连续切取5μm厚度切片，分别进行HE染色，免疫组化测定，光镜下观察心肌变化。

1.2.5 统计学处理

用SPSS 17.0软件进行统计学处理，组内比较用独立样本t检验，组间比较用配对样本t检验，非配对两两比较用ANOVA法后再多重比较，所得数据用均数±标准差表示(±s)，P＜0.05具有统计学意义，P＜0.01具有显著性差异。

2 结果

2.1 病理组织学改变

假手术组:基本无炎性细胞浸润，心肌细胞排列成束，界限清晰，细胞核形态、大小正常，胞浆染色均匀(见图1)。

图1 假手术组HE染色图片

模型组:大量炎性细胞浸润(以PMNs为主)，细胞高度水肿，界限不清，核浓缩或溶解，胞浆淡染，内有红染颗粒，空泡样变，甚至崩解坏死(见图2)。

图2 模型组HE染色图片

药物组:其改变程度依低剂量组(图3)、通心络组(图4)、高剂量组(图5)的顺序减轻，出现不同程度的散在的PMNs浸润，心肌缺血及心肌细胞超微结构的改变。

图3 ACⅡ低剂量组HE染色图片

图4 通心络组HE染色图片

图5 ACⅡ高剂量组HE染色图片

2.2 免疫组织化学结果 结果见表1。

表1 各组大鼠MMP－9的比较(±s)

表1 各组大鼠MMP－9的比较(±s)

注:与模型组比较，#P＜0.01;与假手术组比较，△P＜0.01;与低剂量组比较，*P＜0.01;与通心络组比较，☆P＞0.05。

模型组10 14.45 ±1.20假手术组 10 0.99 ±0.28#通心络组 8 3.42 ±0.85#△＊中药低剂量组 10 10.65 ±1.17#△中药高剂量组 10 3.31 ±0.73#△＊☆

如表1所示，模型组MMP－9与假手术组比较有统计学意义(P＜0.01)，说明缺血再灌注损伤后大鼠心肌组织MMP－9明显升高;抗凝护心Ⅱ号高、低剂量组、通心络组与模型组对比有统计学意义(P＜0.01)，说明抗凝护心Ⅱ号、通心络可降低受损心肌MMP－9的含量，对心肌组织有明显的保护作用;抗凝护心Ⅱ号高剂量组、通心络组与低剂量组比较有统计学意义，说明抗凝护心Ⅱ号高剂量组、通心络组比低剂量组更能降低受损心肌MMP－9的含量;抗凝护心Ⅱ号高剂量组与通心络组对比无统计学意义(P＞0.05)，说明抗凝护心Ⅱ号与通心络组无明显差异。

3 讨论

细胞外基质(ECM)是血管壁的主要成分，其降解贯穿于ACS发生发展的整个过程。而MMPs是一组可降解细胞外基质的重要蛋白酶类，可通过降解纤维膜成分而加速斑块的破裂，同时引起ECM退化，导致心肌排列紊乱，收缩功能异常。MMP－9是MMPs中的一种，由活化的巨噬细胞、血管平滑肌细胞、内皮细胞等以蛋白酶原前体形式由细胞内分泌到细胞外，其作用底物有明胶、Ⅳ型、Ⅴ型胶原等。在人类动脉硬化的斑块肩部及巨噬细胞聚集区显示了MMP－9的表达增高，且所有的斑块抽提物被证实含明胶酶的活化形式，活化MMP－9的过表达可使内皮细胞的ECM降解增强，从而降低斑块的强度，促使斑块破裂。斑块破裂后导致的局部血栓形成使硬化动脉造成的狭窄进一步加重，从而对缺血的心肌造成了损伤。本实验心肌梗死模型组亦显示心肌缺血再灌注损伤后心肌表达为明显的炎性细胞浸润，体现为心肌细胞缺血缺氧导致的急性心肌梗死甚至在反复的缺血缺氧情况下形成的心肌纤维化，从而导致心肌超微结构的改变，心功能的下降。

目前已有多个流行病研究证明，血清中MMP－9的浓度增加与将来冠状动脉事件发生的危险程度呈正相关。本实验结果亦显示，缺血再灌注损伤后大鼠心肌组织MMP－9明显高于假手术组，药物组MMP－9浓度明显低于模型组(P＜0.01)，其中高剂量药物组比低剂量药物组的MMP－9浓度更低，且心肌超微结构的改变在高剂量药物组比低剂量药物组更小，炎性细胞浸润程度更轻，不仅可以证实MMP－9组织浓度与心肌受损程度相关，还证明了抗凝护心Ⅱ号在心肌缺血再灌注损伤后对心肌具有一定的保护作用。

曾有观察表明，不同活血药可作用于ACS的不同环节，其稳定斑块作用亦有所差别，干预炎症反应为其重要作用机制之一［3－4］。本实验用药抗凝护心Ⅱ号为中药复方，以往的动物实验表明，该方可较好的降低血浆ET、TXB2(血栓素)含量，升高NO含量，提高TPA活性，降低PAI(纤维蛋白原激活剂抑制剂)活性，从而降低血液高凝状态、提高纤溶水平、缓解血管痉挛收缩，稳定血管内皮功能，防止心肌再灌注损伤，避免发生再梗。本方中川芎、红花、桃仁等具有活血化瘀功效，黄芪具有益气、扶正、改善受损血管内皮的作用，考虑本药对缺血再灌注损伤的心肌组织的保护可能与减少MMP－9的分泌、减少心肌组织的炎性反应有关，也进一步证实了抗凝护心Ⅱ号在急性心肌缺血中具有心肌保护作用。

［1］周敏，姜璟瑛，段玉敏.仙脉通胶囊对实验性心肌缺血大鼠心肌组织中 NO、NOS的影响［J］.中医药学报，2010，38(4):29－31.

［2］赵宇辉，孙忠人，魏运芳.针灸预处理对缺血再灌注大鼠心肌Bcl－2mRNA和BaxmRNA基因表达的影响［J］.中医药学报，2009，37(1):16－18.

［3］文川，徐浩，黄启福，等.活血中药对ApoE基因缺陷小鼠血脂及动脉粥样硬化斑块炎症反应的影响［J］.中国中西医结合杂志，2005，25(4):345－349.

［4］文川，徐浩，黄启福，等.几种活血中药对ApoE缺陷小鼠动脉粥样硬化斑块影响的形态学研究［J］.中国病理生理杂志，2005，21(8):864－867.