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酶法提取荆芥总黄酮的研究1)

2011-06-02公衍玲金宏黄山金岩张丹丹

中国林副特产 2011年4期
关键词:荆芥酶法黄酮

公衍玲,金宏,黄山,金岩,张丹丹

(青岛科技大学化工学院药学系,山东 青岛 266042)

荆芥为唇形科植物荆芥(Schizonepeta tenuif oliaBriq.)的干燥地上部分,其味辛,微温,归肺、肝经,具有解表散风、透疹、消疮、止血等功效,临床应用广泛。荆芥中的主要化学成分包括挥发油类、酚类、酸类、黄酮类化合物[1],而黄酮类化合物具有降血脂、抑制血栓形成、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、镇痛、保肝等多种生物活性,日益受到国内外学者的关注[2-3]。新的提取技术和方法不断涌现,使黄酮类化合物的提取研究也在不断更新和深入,其中生物酶解技术应用于中药提取呈现出良好的应用前景。是根据植物细胞壁的构成,利用酶反应所具有高度专一性的特点,选择相应的酶,将细胞壁的组成成分(纤维素、半纤维素和果胶质)水解或降解,破坏细胞壁结构,使细胞内的成分溶解、混悬或胶溶于溶剂中,从而达到提取目的,且有利于提高成分的提取率[4]。纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称,具有分解、软化纤维素、破坏细胞壁、增加植物细胞内容物的溶出量的作用,广泛应用于中药有效成分的提取[5-7]。本文拟将纤维素酶用于提取荆芥总黄酮,并获得了最佳提取工艺,现报导如下。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

荆芥,四川省绵阳市;纤维素酶,宁夏夏盛实业集团有限公司;芦丁,中国药品生物制品检定所;其它试剂均为市售分析纯。UV762紫外/可见分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司;DHS-25型pH计,上海精科雷磁;RE-52型旋转蒸发器,上海亚荣生化仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 荆芥总黄酮的酶法提取工艺流程。准确称取荆芥5g,加入一定温度的水中,调节介质的pH,加入一定量的酶,恒温提取一定时间,升温灭酶后再用水浸提1.5h,过滤,将滤液浓缩至约100mL,待测。

1.2.2 荆芥提取物中总黄酮的测定

1.2.2.1 芦丁标准曲线的绘制:精密量取芦丁标准溶液 0 、1.0、2.0 、3.0 、4.0、5.0mL,分别置于 25mL 容量瓶中,各加30%乙醇5mL,再各精密加入5%NaNO2溶液0.7mL,摇匀,放置6min,然后再各精密加入10%Al(NO3)3溶液 0.7mL,摇匀,放置6min,最后再各精密加入1mol/L的NaOH溶液10mL,分别用30%乙醇稀释至25mL,摇匀,放置15min后,置比色皿中,用紫外可见分光光度计在510nm处测吸光度。以浓度为横坐标,吸光度为纵坐标绘制标准曲线,得回归方程为y=9.9943x+0.0103,R2=0.9997。

1.2.2.2 荆芥中总黄酮的测定:取1.2.1项下的滤液2mL置10mL容量瓶中,按照1.2.2.1项下的方法测吸光度,计算总黄酮的质量,并计算总黄酮得率(总黄酮得率=提取液中总黄酮质量/荆芥质量×100%)。

1.2.3 单因素实验设计。影响酶法提取的因素有粉碎度、料液比、酶解温度、酶解 pH 值、酶解时间、酶的用量,按照单因素实验设计思路,考查各因素对总黄酮提取率的影响。

1.2.4 正交实验设计。在单因素实验的基础上,筛选影响提取的主要因素,设计了四因素三水平的正交实验,采用L9(34)表安排实验。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1 料液比对荆芥总黄酮提取的影响

准确称取荆芥各5g,粉碎至60目、40目、30目、20目、10目,按料液比1∶10、酶解温度 40℃、酶解 pH 值4、酶的用量 1.0%(药材干重)、酶解时间30min处理后,煎煮1.5h,实验结果见图1。

图1 粉碎度对荆芥总黄酮提取的影响

随着粉碎度的增加,总黄酮的得率总体上逐渐增加,原因可能是粉碎度的增大有利于增大溶剂与物料的接触面积,从而有利于总黄酮的溶出。当达到50目时,总黄酮的得率变化趋于平缓,且粉碎度的增加不利于分离过滤。因此综合考虑,选择荆芥的粉碎度应为50目左右。

2.1.2 料液比对酶法提取荆芥总黄酮提取率的影响

准确称取50目荆芥各5g,分别加入料液比1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16的水,在酶解温度 40℃、酶解pH值4、酶的用量1.0%(药材干重)、酶解时间30min处理后,煎煮1.5h,实验结果见图2。

图2 不同料液比对荆芥总黄酮提取的影响

随着料液比的增加,总黄酮得率逐渐增加,当料液比达到1∶12时,总黄酮得率达最大值,而后随着料液比的增加,总黄酮得率反而有所下降,但下降的趋势不是很明显。分析可能原因,随着料液比的增大,反应体系中的水分会增加,从而降低了反应产物的浓度,减少了产物对酶促反应的反馈抑制作用,总黄酮得率会增加,但随着反应体系中水分的增加,酶的浓度也会相应的有所下降,总黄酮得率变化趋于平缓。故选择料液比为1∶12。

2.1.3 酶解温度对酶法提取荆芥总黄酮提取的影响

准确称取50目荆芥各5g,料液比1∶10、酶解pH值4、酶的用量1.0%(药材干重)、酶解温度分别设为30 、35 、40、45 、50℃,酶解 30min 后,煎煮 1.5h,实验结果见图3。

图3 酶解温度对荆芥总黄酮提取的影响

随着温度的升高,总黄酮得率随之增大,在35~45℃时达到最大,而后随着温度的升高,总黄酮利率开始下降降低。该纤维素酶的最适温度为40℃,温度过高会破坏酶的活性。

2.1.4 酶解pH对荆芥总黄酮提取的影响

准确称取50目荆芥各5g,按料液比1∶10、酶解温度40℃、酶的用量1.0%(药材干重)、酶解pH值分别设为 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0,酶解 30min 后,煎煮1.5h,实验结果见图4。

图4 酶解pH对荆芥总黄酮提取的影响

从图4可以看出,总黄酮得率随着酶解液初始pH值的增大而增大,在pH=5时达到最大,继续增大pH值,总黄酮利率反而减小。因为纤维素酶的活力受环境pH值影响,在一定pH值下,纤维素酶的反应达到最大速度,pH5即为该该纤维素酶的最适pH值。

2.1.5 酶解时间对荆芥总黄酮提取的影响

准确称取50目荆芥各5g,按料液比1∶10、酶解pH 值4、酶解温度40℃、酶的用量1.0%(药材干重)、酶解时间分别设为20、30、40、50、60、90、120min后 ,煎煮1.5h,实验结果见图5。

图5 酶解时间对荆芥总黄酮提取的影响

从图5可以看出,随着酶解时间的延长,总黄酮利率逐渐下降,酶解50min之后,总黄酮利率基本稳定在一较低的水平。从理论上讲,酶解反应时间和酶解进行程度有着密切的关系,反应时间太短,酶解不充分,而当酶浓度达一定值时,酶促反应时间的延长并不能显著增加浸提率,甚至开始下降。本实验发现,酶解20min即可获得较好的效果。

2.1.6 酶的用量对荆芥总黄酮提取的影响

准确称取50目荆芥各5g,按料液比1∶10、酶解pH值4、酶解温度40℃、酶的用量分别设为 0.8%、0.9%、1.0%、1.1%、1.2%、1.4%(药材干重),酶解30min后,煎煮1.5h,实验结果见图6。

图6 酶的用量对荆芥总黄酮提取的影响

从图6可以看出,总黄酮得率随着酶用量的增大而增加,当酶用量为1.2%时,其浓度为最大,继续增加酶用量,总黄酮得率反而减小。在保持体系中其他成分不变的条件下,随着酶用量的增加,纤维素酶与纤维素分子的接触机会增加,在同一时间内,细胞壁中的纤维素水解速度提高,致使黄酮类化合物很快分离出来;达到最大值后,随着酶用量的增加,底物被酶分子所饱和,酶解反而有可能存在竞争抑制,使酶解不彻底,另外也是酶的一种浪费。酶的用量适宜控制在1.2%。

2.2 正交实验结果

根据单因素实验考察的结果,确定酶解最适pH为5,最佳酶解温度为40℃,其他因素选取最佳实验条件附近的三个水平,进行四因素三水平的正交实验,以总黄酮得率为评价指标,实验结果见表1。

表1 正交实验结果

表2 正交实验的方差分析表

从表1和表2可以看出,各因素对提取效果的影响为粉碎度>酶解时间>酶的用量>料液比,其中粉碎度、酶解时间和酶的用量对提取率的影响均具有显著意义。结合单因素实验结果,最佳提取工艺条件为:药材粉碎至50目,料液比为1∶16,酶的用量为0.8%,酶解温度为40℃,酶解pH值为5,酶解时间为20min后,煎煮1.5h。以此提取工艺做3组验证试验,其总黄酮平均得率为1.174%,说明该工艺条件稳定,提取率高。

2.3 验证实验

按照上述工艺条件进行了三组验证实验,其结果如表3,总黄酮的平均得率为1.174%,最高得率可达1.215%。

表3 验证实验数据表

3 结论

3.1 本文通过单因素实验和正交实验获得了酶法提取总黄酮的最佳工艺条件为:荆芥药材粉碎至50目,料液比为1∶16,酶的用量为0.8%,酶解温度为40℃,酶解pH值为5,酶解20min后,煎煮1.5h。该工艺条件重现性好,荆芥总黄酮得率可高达1.215%。

3.2 酶解预处理与传统水煎法相结合可用于荆芥总黄酮的提取,该法反应条件温和,能耗低,还可避免使用有机溶剂,从而实现中药的绿色提取和清洁化生产。

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