高效液相色谱法测定荷胆胶囊中牛磺熊去氧胆酸含量

兰 鸿，杨务彬，李元宏，陈鸿梅

(湖北医药学院附属十堰市太和医院，湖北 十堰 442000)

荷胆胶囊由熊胆粉[1]、干姜、薄荷油制成，具有解热毒、去肝火、利胆定痛的功效，用于急性胆囊炎或慢性胆囊炎急性发作。熊胆粉为方中主药，属贵重药材，具清热、平肝、明目功效[2]，其含量高低直接影响到药品的疗效。笔者采用高效液相色谱法测定了荷胆胶囊中牛磺熊去氧胆酸的含量[3]，现报道如下。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪(美国Beckman公司)，包括125型溶剂输送系统(双泵)和166型检测器;AE 240型双量程电子分析天平;SB 2200型超声波清洗器。牛磺熊去氧胆酸钠对照品(中国药品生物制品检定所，批号为110816-200507);样品荷胆胶囊和缺熊胆粉的阴性样品均由四川省新鹿药业有限公司提供;甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱:Alltech Alltima C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相:用磷酸调pH至4.4的甲醇-0.03 mol/L磷酸二氢钠溶液(65∶35);检测波长:210 nm;柱温:室温;流速:1 mL/min。在此条件下，牛磺熊去氧胆酸和样品中其他组分的色谱峰可基线分离[4]，牛磺熊去氧胆酸峰与其相邻峰的分离度大于1.5，以牛磺熊去氧胆酸峰计算的理论板数大于2 500，阴性对照品溶液在牛磺熊去氧胆酸色谱峰位置无相应峰出现(图1)。

2.2 溶液制备

取经五氧化二磷减压干燥至恒重的牛磺熊去氧胆酸钠对照品10 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得每1 mL含牛磺熊去氧胆酸钠对照品0.1 mg(折合牛磺熊去氧胆酸为0.096 mg)的对照品溶液。取样品内容物约0.2 g，精密称定，置10 mL量瓶中，加甲醇超声(功率250 W，频率50 kHz)处理30 min，放冷后加甲醇至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，取续滤液作为供试品溶液。取缺熊胆粉的阴性样品内容物约0.2 g，精密称定，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

线性关系考察:精密称取在五氧化二磷容器中减压干燥至恒重的牛磺熊去氧胆酸钠对照品17.64 mg(折合牛磺熊去氧胆酸为16.93 mg)，置25 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得每1 mL含牛磺熊去氧胆酸0.677 mg的对照品溶液。精密吸取上述对照品溶液 6，8，10，12，14，16，18 μL，注入高效液相色谱仪分析。以进样量为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程 A=109 350.528 6 C+2 770.201 4，r=0.999 6(n=7)。结果表明，牛磺熊去氧胆酸进样量在4.067 4～12.2 μg范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验:精密吸取质量浓度为1.01 g/L的牛磺熊去氧胆酸对照品溶液10 μL，重复进样5次，结果峰面积积分值的 RSD=1.29%(n=5)，表明仪器精密度良好。

稳定性试验:取批号为070901的样品，依法配制供试品溶液，室温(20 ～25 ℃)下放置，分别在 0，1，2，4，8 h 时进样，每次 10 μL，测定峰面积。结果的 RSD=1.75%(n=5)，表明供试品溶液在8 h内基本稳定。

重复性试验:取荷胆胶囊(批号为070901)5份，按供试品溶液制备方法配制溶液，准确吸取10 μL，进样，测定峰面积，计算牛磺熊去氧胆酸含量。结果平均含量为38.08 mg/g，RSD为1.03%(n=5)，表明方法重复性良好。

加样回收试验:称取已知含量的样品(批号为070901，含牛磺熊去氧胆酸38.08 mg/g)约0.1 mg，共6份，精密称定后置10 mL量瓶中，分别精密加入牛磺熊去氧胆酸钠对照品溶液(每1 mL含牛磺熊去氧胆酸 0.677 mg)3.0，3.0，5.5，5.5，7.0，7.0 mL，按供试品溶液制备方法制备溶液，准确吸取10 μL，进样测定含量，计算回收率。结果见表1。

表1 牛磺熊去氧胆酸加样回收试验结果(n=6)

2.4 样品含量测定

分别精密吸取牛磺熊去氧胆酸钠对照品溶液(每1 mL含牛磺熊去氧胆酸0.677 mg)和供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，以外标法计算样品中牛磺熊去氧胆酸含量，结果批号为070902，070903，070904，070905，071001，071002，071003，071101，071102，071103的10批荷胆胶囊中，牛磺熊去氧胆酸的含量分别为 31.11，41.32，41.74，42.31，38.89，36.99，35.27，39.72，35.56，36.36 mg/g，平均 37.93 mg/g(n=4)。

3 讨论

本品内容物中熊胆粉为生品入药，未经提取，故以甲醇作为提取溶剂。经试验摸索，取样品0.2 g，加甲醇10 mL，质量浓度与对照品溶液质量浓度匹配。制备供试品溶液时，比较了回流提取和超声提取两种方法，采用超声提取测得的牛磺熊去氧胆酸含量高，且方法操作简便。经考察，超声提取30 min后，所测得的牛磺熊去氧胆酸含量无显著性差异，故确定超声提取时间为30 min。根据10批样品的含量测定结果和《卫生部颁药品标准新药转正标准(第十一册)》熊胆粉项下牛磺熊去氧胆酸含量限度规定，暂定荷胆胶囊中牛磺熊去氧胆酸含量不得低于25 mg/g。

[1]WS3-09(B-09)-96(Z)，卫生部颁药品标准新药转正标准(第十一册)[S].

[2]徐愚聪，王 野.熊胆粉的研究进展[J].华西药学杂志，2000，15(3):200-202.

[3]WS3-B-2641-97，卫生部颁药品标准中药成方制剂(第十三册)[S].

[4]沈 俊，周 聃，张若丹，等.HPLC测定风热清胶囊中的绿原酸和牛磺熊去氧胆酸[J].华西药学杂志，2008，23(3):346-348.