牛病毒性腹泻病毒血清抗体检测

王 文,张 娟,员丽娟,季新成*

(1.新疆动物卫生监督所,新疆乌鲁木齐 830063;2.奇台县动物疫病预防控制中心,新疆奇台 831800;3.新疆出入境检验检疫局,新疆乌鲁木齐 830063)

牛病毒性腹泻病毒血清抗体检测

王 文1,张 娟2,员丽娟3,季新成*3

(1.新疆动物卫生监督所,新疆乌鲁木齐 830063;2.奇台县动物疫病预防控制中心,新疆奇台 831800;3.新疆出入境检验检疫局,新疆乌鲁木齐 830063)

采用Svanova公司牛病毒性腹泻病毒血清抗体ELISA抗体检测试剂盒对采自新疆10个不同地区的875份牛血清进行了牛病毒性腹泻病毒血清抗体检测,共检出抗体阳性血清759份,最高阳性率为100%,最低为55.0%,平均为86.7%。检测结果表明该病已在新疆普遍存在,感染没有明确的地域分布规律。根据ELISA检测结果,从中选择15份血清用病毒中和试验进行检测,结果显示,所采用的ELISA检测方法具有较好的敏感性。

牛病毒性腹泻病毒;血清抗体;ELISA;病毒中和试验

*通讯作者

牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)又称牛病毒性腹泻-黏膜病病毒(Bovine viral diarrhea-mucosal disease virus,BVD-MDV),或黏膜病病毒(Mucosal disease virus,MDV),是导致牛流产、死胎和畸形胎等的重要病原之一,持续性感染BVDV的牛,虽然血清中病毒抗体呈阴性,但却终身带毒排毒。同时,BVDV还是牛源生物制品(血清、冻精、冷冻胚胎及疫苗等)的常在污染源。牛病毒性腹泻病主要发生于牛,犊牛更易感。临床症状主要为高热、白细胞减少,大量流涎、腹泻、减奶甚至停奶,结膜炎、口腔黏膜充血并出现溃疡斑。通常发病率高,病死率低,但急性发作型病死率甚高。

本病是由美国的Olafsan于1946年首次在纽约奶牛中发现的,是欧美各国奶牛和肉牛群的常发病,对养牛业造成严重的危害。该病在世界范围内广泛分布,给畜牧业和相关商业领域造成了巨大的经济损失[1]。我国从20世纪80年代调查发现在牛群中存在BVD,其后在全国20多个省、市都相继发现了该病的存在[2]。新疆奶牛养殖数量位于全国前列,因此调查了解新疆地区该病的发生与流行情况,十分必要。本研究对采自新疆不同地区的875份牛血清进行了BVDV抗体检测,为该病的有效防控提供技术资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂和仪器 牛病毒性腹泻病毒血清抗体酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒为瑞典Svanova公司产品;牛病毒性腹泻病毒(C24V)、标准阳性血清、阴性血清、MDBK细胞,均为中国兽药监察所产品;MEM细胞培养基和新生马血清,为Gibico公司产品;EXL800酶标仪为Bio-rad公司产品,不同量程微量加样器为eppendorf公司产品。

1.1.2 样品来源 被检血清样品875份,分别采自新疆伊犁州、昌吉州、哈密地区、塔城地区和石河子市等10个不同地区。

1.2 方法

1.2.1 酶联免疫吸附试验检测血清抗体及结果判定 875份被检牛血清样品按 Svanova公司ELISA试剂盒说明书进行实验操作。

结果成立条件:阳性对照的平均值(PCx)与阴性对照平均值(NCx)之差(P-N)必须大于或等于0.150的吸光值(OD),另外,阴性对照平均值(NCx)必须小于或等于0.250的吸光值(OD),检测结果有效。按以下公式计算S/P:

式中:SampleA450——被测样品在450 nm下的OD均值;NCx450——阴性对照在450 nm下的OD均值;PCx450——阳性对照在450 nm下的OD均值。

S/P值小于0.2的被检样品判为BVDV抗体阴性;S/P值大于或等于0.2,但小于0.3,被检样品判为BVDV抗体可疑,应重新检测,若再次为可疑则判为阳性;S/P值大于或等于0.3的被检样品判为BVDV抗体阳性。

1.2.2 中和试验(VN)对血清抗体效价的检测

根据ELISA检测结果,从中有代表性的选取15份血清样品(12份阳性、2份阴性、1份可疑),用病毒中和试验检测血清抗体效价,以对两种检测结果进行比较,血清按2倍连续倍比稀释,做6个稀释度(2-1～2-6)。操作方法见文献[3]。

2 结果

2.1 ELISA检测结果

通过对采自新疆10个地区(牛群)的875份牛血清进行 BVDV抗体检测,共检出阳性血清759份,结果显示这些地区牛群中都不同程度的存在BVDV的感染,最高阳性率达100%,最低阳性率为55.0%,平均阳性率为86.7%。从本次结果来看,阳性分布没有明确的地域特征。牛场1为分3次不同时间采样检测,牛场3为2次采样,结果显示其后的时间阳性率呈明显的上升趋势。从有过流产史记录的4个牛场检测数据来看,阳性率基本达100%,一定程度上表明该病导致流产的发生。从所检测的样品来看,结果显示该病已在全新疆普遍存在,且有不断增强的趋势(表1)。

2.2 ELISA与病毒中和试验比较

从检测数据判断,15份被检血清样品中,VN检出阳性样品10份,最高血清滴度为2-6,呈较强的阳性,ELISA试剂盒检出阳性样品12份,可疑样品1份,与VN检测方法符合率为80.0%,VN检测为阴性的血清样品与之对应的ELISA检测都具有较低的OD值或处于可疑范围之内。从以上结果来看,两种检测方法具有一定的线性关系,但ELISA的敏感性较高(表2)。

表1 牛血清样品分布及BVDV抗体检测结果Table 1 Serum samples distribution and antibody results to BVDV

表2 15分血清样品BVDV抗体ELISA检测和VN检测结果Table 2 15 serum samples antibody results detected by ELISA and VN respectively

3 讨论

牛病毒性腹泻在世界范围内广泛分布,20世纪80年代,李佑民等首次报道了从国内牛流产胎儿脾脏分离出BVDV,证实了我国也存在着本病。2005年河北省8个大型奶牛场BVDV血清抗体检测,总阳性率42.6%[4],杨得胜等[5]2006对福建省9个地区大型牛场和散养户牛进行血清学调查,总阳性率达92.5%,表明我国不同地区广泛存在该病的发生与流行。由于BVDV可通过口鼻接触及血液等多种途径传播,且感染BVDV的牛发病率高、死亡率低,因此牛群中相当一部分牛是BVDV的携带者。感染BVDV的孕牛产下的小牛对BVDV有免疫耐受性,可持续感染BVDV,最终有可能发展成致死性的黏膜病而死亡[6]。当已感染的牛免疫机制受到抑制时,无论其体内是否存在病毒或抗体,都会向外界排毒,病牛康复后长期带毒就成为长期的潜在传染源。因此可以认为,在非免疫牛的血清中检测出BVDV抗体,就可确认牛体中有BVDV的存在,并有排毒的可能性[7-8]。

BVDV抗体常用检测方法有VN和ELISA,与病毒VN相比,ELISA检测方法极大的缩短了检测时间,且具有敏感、简便、易于标准化等优点,是进行血清流行病学调查的良好方法[9-10]。我们对15份被检血清同时进行了ELISA法和VN法检测,VN阳性检出率较低,与 ELISA检测方法符合率为80.0%。

我们采用了Svanova公司的ELISA试剂盒对新疆奶牛病毒性腹泻进行流行病学调查,本次采集的被测样品来自南疆和北疆不同地区,具有一定的代表性。结果表明在所调查的地区中均存在牛病毒性腹泻病毒感染,进一步证明该病在新疆地区的广泛存在。调查结果对该病的了解和防控具有重要意义,为促进新疆牛出口,合理选择出口牛群具有积极作用。

[1]张俊杰,凌宗帅,黄 凯,等.北京地区规模化奶牛场牛病毒性腹泻病血清学调查[J].中国奶牛,2010(10):41-42.

[2]张会敏,郑明学,古少鹏,等.牛病毒性腹泻的流行情况及防制[J].中国畜牧兽医,2009,36(11):120-122.

[3]OIE.Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals[M].T he Animal Health&Production Compendium,2010:698-711.

[4]高存福.秦建华,赵月兰,等.牛病毒性腹泻病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立[J].中国兽医科技,2005,35(8):620-622.

[5]杨得胜,黄 雁,洪 英,等.2006年福建省牛病毒性腹泻病的血清学调查明[J].动物医学进展,2007,28(9):49-51.

[6]Brownlie J.Clinical aspects of the bovine virus diarrhoea/mucosal disease complex in cattle[J].In Practice,1985(7):195-202.

[7]Palfi V,Houe H,Philipsen J.Studies on the decline of bovine virus diarrhea virus(BVDV)maternal antibodies and detectability of BVDV in persistently infected calves[J].Acta Vet Scand,1993(34):105-107.

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[9]Brinkhof J,Zimmer G,Westenbrink F,et al.Comparative study of four enzyme-linked immunoso rbent assays and a cocultivation assay for the detection of antigens associated with the bovine viral diarrhoea virus in persistently infected cattle[J].Vet Microbiol,1996(50):1-6.

[10]Graham D A,Beggs N,Mawhinney K,et al.Comparative evaluation of diagnostic techniques for bovine viral diarrhoea virus in aborted and stillborn fetuses[J].Vet Rec,2009,164:56-58.

Serum Antibody Detection of Bovine Viral Diarrhea Virus

WANG Wen1,ZHANG Juan2,YUAN Li-juan3,JI Xin-cheng3

(1.Xinjiang Animal Health Supervise Station,Urumqi,Xinjiang,830063,China;
2Qitai County Animal Disease Prevent and Control Centre,Qitai,Xinjiang,831800;
3.Xinjiang Exit-import Inspection and Quarantine Bureau,Urumq,Xinjiang,830063,China)

In the study,875 serum samples came from 10 different areas or farms,antibody against Bovine viral diarrhea virus(BVDV)was detected used svanova company indirect ELISA kit,759 serum samples were conformed positive.The positive rate was between 55.0%and 100%,and the mean positive rate was 86.7%.The results showed that BVDV is extensive exist in Xinjiang province,and the infection rate no obvious different among different regions.15 samples were chosen and tested by virus neutralization(VN)method,the results showed that the ELISA detection was more sensitive compared with VN test.

BVDV;serum antibody;ELISA;VN

S852.659.6

A

1007-5038(2011)09-051-03

2011-04-08

新疆维吾尔自治区高技术研究发展项目(201010101);国家质量监督检验检疫总局科研项目(2011IK017)

王 文(1968-),女,陕西西安人,高级兽医师,硕士,主要从事动物疫病检测和防控工作。