水牛MD-2 cDNA基因的克隆与原核表达

焦寒伟,杜 丽,雷 明,张冬琳,郝永昌,张晓茹,匡文华,成 鹰,王凤阳*

(1.海南大学农学院,海南省热带动物繁育与疫病研究重点实验室(筹),海口市动物基因工程重点实验室,海南海口 570228;2.华中师范大学生命科学学院,湖北武汉 430079)

水牛MD-2 cDNA基因的克隆与原核表达

焦寒伟1,杜 丽1,雷 明1,张冬琳1,郝永昌1,张晓茹2,匡文华2,成 鹰1,王凤阳1*

(1.海南大学农学院,海南省热带动物繁育与疫病研究重点实验室(筹),海口市动物基因工程重点实验室,海南海口 570228;2.华中师范大学生命科学学院,湖北武汉 430079)

为探讨水牛抵抗革兰阴性菌感染的免疫机制,克隆、表达了水牛髓样分化蛋白-2(bMD-2)基因,并用Western blot进行鉴定。采用RT-PCR方法从水牛外周血白细胞中扩增bMD-2基因,构建pET28abMD-2表达载体,转化至大肠埃希菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果显示,bMD-2基因含有一个483 bp的开放阅读框,编码161个氨基酸;37℃条件下,经1 mmol/L IPTG诱导表达6 h后,His-bMD-2在E.coliBL21中表达量最高,并以包涵体的形式存在,融合蛋白的分子质量约为25 ku。结果表明水牛MD-2原核表达载体成功构建并表达,为继续深入对水牛MD-2基因功能的研究提供参考。

水牛;MD-2;克隆;原核表达

*通讯作者

MD-2是结合在Toll样受体4(toll-like receptor 4,TLR4)胞外区的一种髓样分化蛋白[1-2],它和TLR4组成的复合体(MD-2/TLR4)能识别细菌脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)、纤维粘连蛋白、热休克蛋白和紫杉醇等的配体,进而介导炎症反应[3-4]。髓样分化蛋白-2(myeloid differentiation-2,MD-2)还是天然免疫中的调控分子,在炎症、感染、免疫等病理过程中发挥极为广泛的生物学功能[5-7]。

水牛(Bubalus bubalus)广泛分布于中国南方,在生产中具有重要的经济价值(劳役、产奶和产肉)。目前,对MD-2的研究主要集中在黄牛和小鼠,已发现多种全身炎性反应性疾病的发生与MD-2参与的信号通路相关,但国内外对水牛MD-2基因的研究尚未有相关报道。本文通过对水牛MD-2基因的克隆表达,为继续对MD-2功能的研究提供参考,对提高我国水牛抗细菌性疾病能力具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

水牛血液采自海南本地兴隆水牛。原核表达载体pET28a为上海捷瑞生物工程有限公司产品;胶回收试剂盒、TaKaRa RNA iso Reagent、PMD20-T Vector试剂盒为宝生物(大连)有限公司产品;血液总RNA提取试剂盒为上海华舜生物工程有限公司产品;小量质粒提取试剂盒为北京天根生化科技有限公司产品;小鼠抗His单克隆抗体为Merck公司产品;HRP标记山羊抗小鼠IgG为Invitrogen公司产品;ECM显色试剂盒为武汉博士德公司产品;Ni2+-NTA Superflow为QIAGEN公司产品。其他试剂均为国产分析纯。大肠埃希菌(E.coli)DH5α和BL21(DE3)由本实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 引物 根据已知MD-2序列设计两对特异性引物,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,引物序列如下:

Forward:5＇-AACATGTT TCCAT TTCTGC-3＇,Reverse:5＇-CTAATTGAAATCAGGGTAATGTATG-3＇;

P1:5＇-GTGTGAATTCATGTT TCCAT TTCTGCTT-3＇,P2:5＇-GGCTAAGCT TATTGAAATCAGGGTAATG-3＇。

下划线处分别表示添加的EcoRⅠ和HindⅢ限制性酶切位点。

1.2.2 水牛外周血白细胞总RNA的提取 参照申明霞的方法提取总RNA[1]。

1.2.3 RT-PCR 以 1.5 μL总 RNA(含量约 1 μg)为模板,按试剂盒说明书利用 Revert AidTMH Minus First Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA第一链,以F、R为引物进行降落PCR。反应条件为:94℃3 min;94℃30 s,66℃30 s,72℃1 min,每个循环退火温度降低1℃,当其降至44℃时;以94℃30 s,44℃30 s,72℃1 min进行28个循环;最后,72℃后延伸5 min。反应完成后,用10 g/L琼脂糖凝胶电泳,回收目的条带。TA克隆后,经菌落PCR并提取质粒酶切鉴定后送上海生工生物工程技术服务有限公司测序,将此重组质粒命名为PMD20-bMD-2。

1.2.4 序列生物信息学分析 利用测序结果,采用DNAMAN软件分析其核酸及其所编码蛋白的生物学特征。

1.2.5 重组表达质粒pET28a-bMD-2的构建 以构建好的PMD20-bMD-2为模板,P1、P2为引物扩增bMD-2编码区,在T4 DNA聚合酶的作用下,将回收的经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切的PCR产物及经同样酶处理的pET-28a载体,在16℃条件下,过夜连接,连接产物转化E.coliDH5α,涂板,挑选阳性克隆,提取质粒,酶切鉴定后测序。

1.2.6 pET28a-bMD-2的诱导表达与可溶性分析将含阳性重组质粒的细菌培养物于37℃培养,当OD600nm=0.6～0.8时,加入IPTG至终浓度为0.01 mmol/L～5 mmol/L,诱导6 h后取样,进行SDS-PAGE筛选出的最佳诱导浓度;以最佳浓度分别诱导 1、2、4、6 h后取样 ,用 120 g/L 的变性胶进行SDS-PAGE,确定最佳诱导时间。以最佳诱导时间、浓度的IPTG诱导10 mL菌液,离心经超声波裂解,分别取上清和沉淀,进行SDS-PAGE电泳,对重组蛋白进行可溶性分析。

1.2.7 融合蛋白的Western blot 经SDS-PAGE电泳后,将蛋白电转移至 PVDF膜上。用 50 g/L脱脂牛奶TBST(含0.5 mL/L Tween 20)室温封闭2 h,TBST洗涤5次,一抗为抗His×6单克隆抗体(1∶1 000);二抗为辣根过氧化氢酶标记的羊抗小鼠IgG-H RP(1:2 000),DAB显色,至目的条带染色清晰时终止显色。

2 结果

2.1 pET28a-bMD-2原核表达载体的构建

以质粒PMD20-bMD-2为模板,P1、P2为引物,扩增整个编码区,得到约483 bp的特异性片段。将该片段用EcoRⅠ/HindⅢ双酶切处理后克隆入同样酶切处理的 pET28a载体,转化E.coliDH5α,提取质粒用EcoRⅠ/HindⅢ进行双酶切鉴定,得到约5 000 bp与483 bp的条带(图1)。说明bMD-2已成功连入pET28a载体中,测序进一步确定读码框架正确,将该重组质粒命名为pET28a-bMD-2。

2.2 bMD-2生物信息学分析

将测序所得水牛MD-2的核酸序列利用DNAMAN软件进行分析(图 2),并与黄牛(AB_072456)、猪(NM_001104956)、兔(NM_001082787)和小鼠(NM_001159711)、和的核酸序列进行同源性比对,结果表明水牛MD-2与黄牛、猪、兔和小鼠MD-2核酸序列的同源性分别为98.76%、81.99%、78.88%和67.91%,氨基酸同源性分别为97.50%、71.25%、66.25%和58.75%。

图1 重组质粒酶切鉴定结果Fig.1 Enzyme digestion analysis results of recombinant plasmid

2.3 融合蛋白的表达与条件的优化

DNAMAN软件分析结果显示,CDS区编码蛋白为19 ku,融合蛋白的前后加上His标签而使分子质量达到 25 ku左右。37℃条件下,0.01 mmol/L～5 mmol/L IPTG诱导6 h后结果发现,当IPTG浓度为1 mmol/L,目的蛋白的表达量最高(图 3);1 mmol/L IPTG 分别诱导 1 、2、4、6 h,蛋白表达量增多(图4);表达菌经过超声波破碎处理,取上清和沉淀分别电泳,发现目的蛋白以包涵体形式存在(图5)。

2.4 融合蛋白的Western blot

融合蛋白进行Western blot。TBST洗膜后进行DAB显色,在分子质量约25 ku处有一特异的条带,说明目的蛋白成功表达(图6)。

图2 bMD-2 CDS序列及推导的氨基酸序列Fig.2 bMD-2 CDS sequence and deduced amino acid sequence

图3 不同浓度IPTG诱导蛋白的表达Fig.3 Expression of induced protein under different IPTG concentrations

图4 不同时间诱导蛋白的表达Fig.4 Expression of induced protein at different time

图5 重组蛋白可溶性分析Fig.5 Solubility analysis of recombine protein

图 6 重组蛋白western blot鉴定Fig.6 Western blot analy sis of the recombinant protein

3 讨论

MD-2、TLR4以及白细胞分化抗原14(cluster of differentiation antigen14,CD14)三者通常组成复合物受体识别LPS,完成信号转导[8]。复合物结构的完整性是其发挥功能的基础,其中,MD-2能与TLR4胞外区结合,使其对LPS更敏感,从而增强其信号转导强度[9-10]。

LPS在内毒素结合蛋白(LPS binding protein,LBP)的参与下,主要作用于膜结合型CD14(membrane CD14,mCD14),再通过一系列信号通路引起细胞的活化或损伤[11-13];而MD-2在大多数情况下是与TLR4、CD14形成复合物后才能识别LPS。

研究表明,LPS可以迅速上调肝脏组织中TLR4/MD-2的基因表达并诱导 TNF-α的表达,因此,MD-2的功能研究对治疗肝脏相关疾病具有重大意义[14];此外,MD-2功能的研究对于治疗脓毒症也具有重要意义[15-16]。为了深入研究水牛MD-2在感染、免疫、炎症等过程中的重要作用,我们构建了原核表达载体,实现了His-MD-2的融合表达,不但为MD-2相关研究做必要的准备,还将为从细胞信号转导通路的角度研究与水牛MD-2相关疾病作铺垫。

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Cloning and Prokaryotic Expession of MD-2 from Buffalo

JIAO Han-wei1,DU Li1,LEI Ming1,ZHANG Dong-lin1,HAO Yong-chang1,ZHANG Xiao-ru2,KUANG Wen-hua2,CHENG Ying1,WANG Feng-yang1

(1.College of Agriculture,Hainan University,Hainan K ey Lab of Tropical Animal Reproduction&Breeding and Epidemic Disease Research(Construction Period),Animal Genetic Engineering Key Lab of Haikou,Haikou,Hainan,570228,China;2College of Li fe Sciences,Huazhong Normal University,Wuhan,Hubei,430079,China)

This study was designed to clone and express buffalo myeloid differentiation-2,and then carry out Western blot for it.RT-PCR was used to clone CDS area of buffalo MD-2,and the PCR products of bMD-2 were cloned into pET-28a,and transformed intoE.coliBL21.The bioinformatics analyses were performed.The protein expression was induced by IPTG and analyzed by SDS-PAGE and Western blot.The results showed that the bMD-2 CDS contain a 483 bp ORF,which encodes 161 amino acids,and His-bMD-2 fusion protein was expressed inE.coliBL21(DE3)with molecular weight of 25 ku induced at 37℃,6 h by 1 mmol/L IPTG,which indicated that prokaryotic expression vector of buffalo MD-2 was constructed and expressed successfully.

buffalo;MD-2;cloning;prokaryotic expression

Q785

A

1007-5038(2011)09-0009-05

2011-05-06

国家转基因生物新品种培育重大专项(2009ZX08007-009B)

焦寒伟(1987-),男,重庆彭水人,硕士研究生,主要从事动物功能基因组学研究。